黄瓜花叶病毒病防治策略研究进展

    植物病毒病是危害农作物的一类重要病害，因其危害大、防治困难而有植物癌症之称。近年来，植物病毒病在果树、蔬菜、花卉以及多种经济作物上的危害越来越严重。大量研究证明，植物病毒病多数是由烟草花叶病毒（TMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）引起的。黄瓜花叶病毒能侵染1000多种单、双子叶植物，可经75种蚜虫传播，有些分离物还可通过种子传播，是寄主植物最多、分布最广、最具经济重要性的植物病毒之一。能引起多种蔬菜产生花叶、坏死、枯萎等，为害面积大。为了减轻其在生产上的危害，多年来科研工作者尝试了多种不同方法防治CMV，提出了不同的防治策略。本文拟对相关内容进行探讨，以寻求高效的黄瓜花叶病毒防治策略。    1 黄瓜花叶病毒（CMV）概述    1.1 CMV分类及危害    黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）属雀麦花叶病毒科（Bromo viridae）黄瓜花叶病毒属（Cu cumo virus）的典型成员。白Doolittle和Jagge分别报道CMV是黄瓜花叶病的病原以来，各国学者相继报道了CMV的危害。近10多年来，CMV在一些国家和地区的许多作物上造成严重危害，如引起番茄的坏死、香蕉的花叶（心腐）、豆科植物的花叶、瓜类的花叶、西番莲的死顶等。此外，许多过去被认为是新的病毒，现已被证实为CMV新的株系。几十年来，各国学者根据他们分离到的CMV的寄主范围及症状表现得到许多株系或分离物，迄今，全世界已报道了100多个CMV株系（如Fny、Y、O、NT9、lx、Q）或分离物。    1.2 CMV微观结构及RNA组成    黄瓜花叶病毒为直径约29nm的二十面体的小颗粒，颗粒分子量约为5.3×10E6，其中18%是RNA，82%是蛋白质。CMV是单链RNA病毒，属三分体基因组，包括4个RNA片段，即RNA1～4，其分子量分别为1.01×10E6、0.89×10E6、0.68×10E6、0.33×10E6。RNA1～3的长度分别为3.3×10E3b、3.2×10E3b、2.2×10E3b。RNA1和RNA2分别编码111×10E3D和97×10E3D2个蛋白，RNA3含编码3a蛋白基因和外壳蛋白（CP）基因，编码一个移动蛋白（即3a蛋白，30×10E3D）和一个外壳蛋白（24×10E3D）。1976年美国农业部研究中心的Kaper等发现，有些CMV中除含有病毒本身的4段RNA外，还有一种分子量更小的RNA5（1×10E5），称为卫星RNA5。研究发现卫星RNA不能独立侵染和复制，完全依赖于CMV的辅助作用，但卫星RNA能干扰CMV复制，降低CMV浓度。    2 黄瓜花叶病毒防治策略研究进展    2.1 药剂防治    由于植物病毒对植物细胞的绝对寄生性，病毒复制所需要的物质、能量、场所等完全由寄主提供，而且植物没有动物那样完整的免疫代谢系统，给高选择性的化学抗病毒制剂的研究与开发以及植物病毒病的防治带来很大的困难，至今尚无有效的抗病毒治疗剂。    黄瓜病毒病的发生与蚜虫的发生情况密切相关。蚜虫是CMV传播的主要媒介，一般蚜虫密度高，CMV的发病率也高，蚜虫密度低，CMV的发病率也低。特别是高温干旱天气可促进蚜虫的繁殖和传毒。因此利用药剂杀死蚜虫，可有效切断传播途径，达到防治CMV的目的。但目前生产上使用的防治蚜虫的药剂多数是剧毒农药，如氧化乐果、甲胺磷等，一些生物农药防治效果不很理想。因此，通过使用农药防治蚜虫不仅污染环境，而且提高农业成本投入和降低产品质量安全系数。    2.2 黄瓜花叶病毒疫苗的研制    田波等把CMV基因组RNA和卫星RNA按1∶1的比例混合，接种到多种植物上，选取无致病力的分离物，组建成CMV生物防治制剂（疫苗）S51、S52，该制剂可使青椒和番茄病情指数降低50%左右，果实增产30%左右。此外，它还具有促进果实早熟和降低真菌病害危害的作用，在生产上曾有一定应用面积。疫苗的应用虽具有无公害的优点，但其防治效果不够稳定，易受环境条件影响。    2.3 筛选具有抗CMV基因的种质资源，选育抗病新品种    对现有的栽培种和野生种进行接种鉴定，筛选具有抗（耐）CMV的种质资源，运用杂交育种和系统选育的方法选育获得了一些抗（耐）CMV的烟草、番茄、辣椒新品种和品系。这种方法育种周期长，效率低，且许多重要的经济植物目前尚未找到抗CMV基因，筛选获得的新品种和品系多数对CMV耐病程度不同，而不是真正的抗病，在缺少抗源的情况下，通过这种方法很难选育出抗病新品种。    2.4 利用基因工程技术，创造新的抗CMV种质资源    目前植物抗病毒基因工程主要包括3个领域，第1个领域是利用病毒本身的基因导入受体植物，获得抗性植株，所获得的抗性也称病原起源的抗性（pathogen-derived resistance）。这一领域的研究较多，已育成了不少抗性品种；第2、3个领域是分别利用植物中自然存在的抗性基因和植物、微生物的核糖体失活蛋白（RIPs）基因，获得抗病毒植物。第1个领域又包括利用病毒外壳蛋白（coat rotein，CP）基因、病毒复制酶（replicase）基因、病毒运动蛋白（movement pro tein，MP）基因、病毒反义RNA（antisense RNA）、核酶（ribozyme）基因、病毒卫星RNA（satellite RNA）等方法介导病毒抗性。目前在抗CMV转基因中利用较多的是CMV CP基因、CMV复制酶基因、CMV卫星RNA、CMV MP基因介导抗性。    ①CMV CP基因介导病毒抗性研究 导入CMV CP基因是目前介导CMV抗性较为成功的一种方法。外壳蛋白是形成病毒颗粒的结构蛋白，其功能是包裹病毒的核酸（DNA或RNA），保护病毒核酸。20世纪50年代研究发现植物病毒具有交叉保护现象；20世纪70年代研究发现病毒外壳蛋白注入寄主体内具有抑制病毒侵染作用。人们从中得到启示：病毒外壳蛋白可能在病毒侵染中起重要作用。1986年Beachy研究小组首先将烟草花叶病毒（TMV）的外壳蛋白基因导入烟草，培育出了抗TMV的烟草植株。目前国内外已有包括CMV在内的30多种病毒的外壳蛋白基因被导入多种植物中，并获得了对病毒的抗性。我国科研工作者成功地将CMV CP基因导入番茄、西番莲、甜椒、黄瓜等蔬菜作物，转化的植株对CMV侵染表现出不同程度的抗性。    外壳蛋白介导抗性的作用机理可能有以下两种情况：a.外壳蛋白包被理论。这是目前较为流行的理论。一种病毒感染植株后会复制产生大量外壳蛋白，使再次侵入的另一种病毒无法进行脱壳或脱壳后核酸被另一种外壳蛋白包被，从而干扰第二种病毒的复制；b.病毒外壳基因的RNA参与干扰病毒的复制。    通过导入病毒CP基因获得的抗病植株，抗性常表现以下特点：a.抗性能力与CP蛋白的表达量呈正相关；b.抗性与接种的病毒浓度有关，高浓度病毒接种能克服CP介导的抗性；c.抗性只对病毒粒子起作用，一般不抗裸露的病毒RNA的攻击。    ②CMV复制酶基因介导病毒抗性研究　植物抗病基因工程另一个重大进展是利用病毒RNA复制酶基因的一部分转化植物。非完整或非正常复制酶基因表达产物干扰了正常病毒的复制过程，导致病毒复制受到抑制和病毒基因非正常表达，使其无法继续侵染和繁殖，这些是复制酶基因介导抗病性的主要原因。Anderson等将CMV Fny株系的RNA2内部缺失94个核苷酸后利用农杆菌介导转入烟草，获得的转基因植 株对CMV表现高度的抗病性。谢响明用缺失的复制酶基因通过农杆菌介导转化烟草和番茄品种，转基因烟草、番茄对CMV表现较高的抗病性。利用病毒复制酶基因介导的抗性具有以下特点：a.对完整的病毒粒子和裸露的病毒RNA都具有高度的抗性；b.高浓度接种条件下抗性不变；c.抗病水平与基因整合的拷贝数无关；d.抗性持续时间长，而且对高温不敏感；e.抗性具有较好的稳定性和株系专化性。因而利用转复制酶基因组分有望获得高水平的抗CMV植株，其不足之处是抗性范围过于狭窄。    ③卫星RNA介导病毒抗性研究 卫星RNA是独立于病毒基因组之外，依赖于其辅助复制的小分子RNA。一般认为由卫星RNA介导的抗病机制是卫星RNA与病毒RNA竞争复制酶，从而干扰病毒基因组的复制，使表达卫星RNA的转基因植株抗病性得到提高。美籍印尼学者Kaper等在1976年首次发现CMV卫星RNA。1986年，英国科学家Baulcombe把CMV的卫星RNA转成cDNA，再转入烟草，第一次得到了抗CMV的转基因植株，1989年我国学者吴世宣等也成功获得了CMV卫星RNA介导的抗CMV烟草。Harrison等（1987）将一个编码CMV卫星RNA的基因转到了烟草植株基因组中，获得抗CMV的转基因植株。卫星RNA介导抗性具有低水平卫星RNA表达可起到抗病毒作用，不致于对植物产生危险的优点，但是这种方法存在着一些缺陷：含有卫星RNA的病毒种类少，大大限制了此法的应用范围；卫星RNA有良性和恶性之分，恶性可加重病症，而且良性与恶性卫星RNA的DNA序列同源性较高，同时卫星RNA突变率高，良性易转化为恶性；另外，卫星RNA转化的植株只是作物生长晚期抗病。    ④CMV MP介导抗性研究进展 植物病毒侵染宿主植物后在体内的运转方式主要有两种，一是通过植物维管组织进行的系统转移，二是通过胞间连丝在细胞之间的移动。病毒在细胞间的移动是一个主动的过程，需要病毒编码的蛋白参与，这种蛋白称运动蛋白（movement protein，MP）。运动蛋白可与胞间连丝相互作用，促进病毒在细胞间的转移。如果能够干扰或阻碍运动蛋白与胞间连丝的结合，就可以阻止病毒在植物体内的扩散，将侵入植物体内的病毒局限在最初的侵染部位，从而达到抗病毒的目的。为探讨MP在促进病毒通过胞间连丝转移中所起的作用，Cooper等将TMV编码的30kD的运动蛋白（P30）完整编码区及缺失了5′端的RNA结合区的突变基因导入烟草，发现转完整P30基因的植株发病明显快于对照植株，而转缺失突变型P30基因的植株对病毒感染具很强的 抵抗作用。后来的一些研究也表明，只有缺陷型或异 源的MP才能介导转基因植株对病毒的抗性；而有功能的完整MP或者对病毒侵染不起作用，甚至提高寄主对病毒的敏感性。张振臣等将4种不同缺失类型的Fny-CMV，MP基因导入烟草，其中含有N端缺失501个核苷酸的K130基因片段的转基因烟草，对CMV表现较好抗性。    关于其抗病机理，一般认为转基因植物缺失型MP和植物病毒正常的MP在寄主细胞的胞间连丝上有共同结合位点。转基因植物中所表达的缺失型MP抢占了胞间连丝上的病毒MP的结合位点，病毒侵入植株后，正常的MP就失去了与胞间连丝结合的机会，从而阻碍了病毒在细胞间的移动。研究表明，MP基因介导的抗性具有广谱性。MP转基因植株不仅对MP基因来源病毒具有抗性，同时对其他一些病毒也具有抗性。如TMV部分缺失的MP基因转基因烟草植株不仅对TMV产生抗性，对CMV、烟草脆裂病毒等也具有抗性。目前报道的MP基因介导抗病性的例子还不多，但随着MP基因介导抗病性研究的深入，将有助于设计出更广谱、更有效的抗病毒新策略。    2.5 运用植物细胞工程技术结合理化诱变因子诱变筛选抗CMV突变体    植物组织和细胞培养技术的发展为在细胞水平上筛选抗病突变体提供了新的途径。自从Carlson（1973）在烟草叶肉细胞原生质体和单细胞培养中，利用野火病毒诱变抗烟草野火病突变体以来，许多学者利用细胞培养技术结合理化诱变因子在许多作物上获得了抗病突变体。王万军等利用60Co-γ射线照射花药，经细胞培养获得抗黄瓜花叶病毒的突变体植株。陈廷俊采用组织培养、化学诱变与病理学方法相结合，初步建立了一个烟草抗CMV细胞突变系筛选系统，并从普通烟草良种Burley18中筛选到抗CMV细胞突变系。这些尝试为创造抗CMV种质资源提供了新的途径。    3 小结和展望    ①药剂防治主要切断传播途径，由于污染环境和产品、危及人的健康，在生产应用上受到越来越多的限制。生物制剂、疫苗等由于其防治效果不稳定、防效不明显，应用范围也很难扩大。    ②由于自然界缺少CMV抗源，利用常规育种手段很难获得真正的抗病新品种，育成的多是一些耐病品系，且由于常规育种的技术特点，育种需要的周期长，选择效率低。    ③基因工程技术由于具有可利用的基因资源丰富、育种周期短、抗性稳定、不污染环境等优点，在抗病育种中受到了普遍关注。通过植物基因工程技术的应用，基因资源的研究与常规育种技术相结合，可望培育出新一代抗病新品种。目前通过基因转化技术已获得了一批对CMV具有较好抗性的转基因植株，为生产上减轻CMV的危害起到了一定的作用。    ④运用植物细胞工程技术结合理化诱变因子诱变筛选抗CMV突变系，为短期、高效创造抗CMV突变系提供了有益的尝试，但其预见性和成功率较差。    相信随着生物技术的发展及其在抗病育种上的应用，CMV在生产上的危害必将得到有效的遏制。