雏鸭病毒性肝炎的诊治技术

鸭病毒性肝炎(Duck virus hepatitis,DVH)简称鸭肝炎,是主要发生于3周龄以下雏鸭的一种传播迅速、高度致死性的传染病。1950年,Levine P P和Fabricant J在美国首先报道了Ⅰ型鸭病毒性肝炎的发生。1954年,Asplin报道鸭病毒性肝炎在英国暴发流行。随后,加拿大、西德、意大利、印度、法国、匈牙利、日本等国均有报道。1963年首次报道在我国的上海地区某些鸭场也发生鸭病毒性肝炎DHV-Ⅰ型。而DHV-Ⅱ型和DHV-Ⅲ型病毒分别于1965年发现于英国诺福克和1969年发现于美国长岛,DHV-Ⅱ型至今尚无其他国家的报道。但近年来，国内外学者相继报道了DHV-Ⅰ型的变异情况,Barnhardt株是在美国一个农场分离到的一个明显的血清学变异株,与DHV-Ⅰ型在中和试验中呈部分交叉反应。在福州地区发现不能被标准DHV-Ⅰ型疫苗保护的鸭肝炎。苏敬良等从疑似鸭肝炎的病死鸭体内分离到1株与Ⅰ型、Ⅲ型鸭肝炎病毒无血清学交叉免疫反应的小RNA病毒,暂时将其病毒称为新型鸭肝炎病毒。在该病的诊断上,依据其发病日龄、临床症状和病理变化可做出初步诊断，但确诊和病毒定型必须依赖进一步的病原学和血清学诊断。目前，应用于DHV的血清学诊断主要有中和试验、酶联免疫吸附试验、琼脂免疫扩散试验、间接血凝试验和免疫荧光等,下面就近年来的诊断方法做简要概述。1 临床诊断该病主要发生于3周龄以下的雏鸭,潜伏期短,常突然发病,感染雏鸭首先表现为跟不上群,此后短时间内就停止运动,蹲伏并半闭眼。病鸭身体侧卧、两腿痉挛后踢,头向后背,呈角弓反张样。雏鸭在出现症状后1 h左右就发生死亡。剖检特征性病变主要在肝脏,常表现为肝脏肿大、质脆,外观淡红、土黄或斑驳状,表面有弥漫性出血点或出血斑；胆囊肿胀呈长卵圆形充满胆汁,胆汁常呈褐色或淡茶色；脾脏和肾脏也多有不同程度的肿胀,表面有出血点或呈斑驳状；心肌常呈淡灰色,质软有淤血,似开水煮样；此外,部分病例还可见喉、气管、支气管等有轻度卡他性炎症及脑充血、出血等现象[5]。根据该病的发病情况、临床症状和病理变化可作出初步诊断。2 实验室诊断2.1 病毒的分离和初步鉴定病毒初代分离一般使用鸭胚,在鸭胚中连续传几代后,很容易在鸭胚中增殖,Levine和Fabricant（1950）首次用鸭胚分离DHV获得成功。因目前国内尚无SPF鸭场,而鸭胚中又往往含有DHV母源抗体,妨碍病毒增殖,故试验研究以及制作疫苗时接种和传代常用SPF鸡胚,病毒感染后主要表现为胚胎蜷缩,发育不良,全身水肿,体表充血且头颈、背部等常有散在的针尖大小的出血点。肝脏为土黄、灰绿或鲜红色,肿大、质脆,出血点明显,边缘坏死或在表面有灰绿色或黄白色坏死区,呈花斑状,此外,有的鸡胚尿囊液和卵黄囊还常呈绿色。胚体变化有一定的诊断意义。获得高纯度的病毒抗原可以对病毒进行电镜直接观察,并开展免疫学监测、诊断以及分子生物学研究。Taylor(1967)试图以硫酸铵沉淀、超速离心方法对细胞增殖的DHV进行纯化,但未能最终达到目的。以后很多学者尝试着先离心初提,然后经氯仿抽提,PEG反透析浓缩蔗糖密度梯度离心等方法进行提纯,以得到较为纯净的病毒,也未能如愿。杨奎以抗DHV IgG偶联活化的Sepharose4B制成亲和层析柱,提纯感染致死的雏鸭肝脏匀浆中的病毒,电镜下背景干净,杂蛋白少,病毒大小约为40 nm,但病毒的特性未进一步验证。孙刚等在电镜下可见到直径为32 nm～49 nm的病毒粒子,颗粒结构清晰,大小和结构均符合Ⅰ型ＤＨＶ的特征。DHV由于病毒颗粒较小,得到较为纯化的病毒一直困扰着研究者,很多学者通过各种提纯的方法进行尝试,但至今尚未见到一张确切的纯化病毒的电镜照片。2.2 中和试验由于至今尚未明确DHV的基因序列,因此该病的实验室诊断主要依靠血清学中和试验加以诊断。Levine P R等（1950）首先将中和试验(Virus-neutralization test, VN)应用于DHV诊断鉴定,以后逐渐为各国学者所引用。通常在鸡胚上以固定血清-稀释病毒法进行,也有人在鸭胚、雏鸭或病毒适应细胞中进行试验。Hwang记述了一种准确、可重复的Ⅰ型鸭肝炎病毒鸡胚中和试验。Woolcock P R等[9]首先报道了用中和抗体进行的空斑减少试验,认为要比鸡胚中和试验敏感得多。Chalmers和Woolcock检测了从16个非感染鸭收集的血清,其半数空斑减少滴度(VN)在1∶12到1∶250之间,平均1∶59。他们建议阴性对照血清的最大空斑减少滴度应设为1∶250。Kaleta E F[10]用北京鸭肾细胞培养的DHV进行了微量中和试验,既快速又易于判定终点。陈琨等成功地在鸭胚单层肝细胞上进行了DHV-Ⅰ型的微量血清中和试验,发现DHV形成CPE的能力可以被特异性血清中和,可以用于病毒鉴定、疫病诊断和免疫检测。到目前为止,VN仍是诊断鸭病毒性肝炎的最可靠的方法,该方法被认为是既特异又敏感,是公认的方法。缺点为烦琐、费时，不能快速诊断,不适于基层应用。2.3 琼脂免疫扩散试验Murty等(1961)首次报道采用琼脂扩散试验诊断DHV。通过不同距离、不同浓度的抗原与高免血清沿琼脂带发生的琼扩反应,可用来检测病毒抗原的滴度。许伟琦等试验表明在琼脂中加入2%PEG能加快反映速度。张济培等用琼扩试验检测提纯后的DHV,发现琼脂凝胶配制的最佳方案是pH7.2,NaCl为80 g/L和琼脂糖浓渡为10 g/L。琼脂扩散试验虽然简便易行,但准确性存在欠缺,并且有干扰,因此存在着一定的局限性。2.4 间接血凝试验司兴奎等报道在纯化DHV获得较为满意结果的基础上,进一步应用纯化抗原进行间接血凝试验（IHA）。孙泉云等将初提DHV经Sephadex G200柱层析纯化后作为致敏抗原,戊二醛法固定绵羊红细胞,BDB法致敏抗原红血球建立了检测DHV抗体的IHA方法。IHA试验敏感性高,所以致敏用抗原的纯度要求高,而且必须保持良好的免疫活性。还有报道说21日龄前不易检测到IHA抗体。所以对DHV早期诊断不适用。在敏感性和稳定性方面有波动,限制了该方法的推广应用。2.5 直接荧光抗体检测Maiborda(1972)报道了快速和准确的诊断方法是接种雏鸭采用直接荧光抗体检测（FA）。用FA确定了北京地区流行的DHV为I型。胡清海等用鸭胚细胞做成滴片进行FA检测DHV。刘建采用感染新型鸭肝炎强毒后死亡鸭的肾细胞做滴片进行荧光染色,可检测到病毒抗原存在,为临床上快速诊断新型鸭病毒性肝炎提供了一种检测方法。该方法准确简便,但对设备要求较高。2.6 斑点免疫金渗滤法张小飞等[18]用胶体金标记提纯后的兔抗鸭肝炎病毒(DHV)IgG,建立了一种以微孔滤膜为固相载体,以红色胶体金为标记物的检测DHV的斑点免疫金渗滤法（DIGFA）,并确定了最佳试验条件。该法既可定性,亦可定量,对纯化DHV的最小检测量为4.12 ng/点,其敏感性为抗原斑点试验(AST)的2倍。DIGFA 法具有敏感性高、特异性强、重复性好等优点。但其要求较高的抗原纯度,这一点难以达到。2.7 酶联免疫吸附试验应用酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）进行抗原、抗体的检测,比较敏感、快速,已经广泛应用于各种疾病的诊断。赵新柳等首次建立了间接ELISA法以检测DHV抗体,结果表明，ELISA阳性检出率为100%。陈溥言等[20]报道了DHV单克隆抗体的成功制备,并建立了检测DHV的夹心ELISA方法,随后范伟兴等[21]用单克隆抗体建立了Dot-ELISA检测方法。杨奎等用辣根过氧化物酶标记法成功地检测了DHV抗体。该法与以polyomyl板或polystyrene为固相载体的ELISA法相比,抗原用量少,很适于DHV这类难以提纯的病毒的抗体检测。孙泉云等将单抗的高度特异性与ELISA的高度灵敏性结合起来,建立了用以检测DHV抗体的单抗捕捉法ELISA方法,该法能有效区分阴、阳性血清,非特异性背景很小。同时对抗原的纯度要求也很低,甚至是尿囊液也能克服非特异性反应。杨萍萍等制备了DHV单克隆抗体,并用于检测DHV。马秀丽等[23]用辣根过氧化物酶标记纯化的Ⅰ型DHV单克隆抗体建立了检测DHV的Dot-ELISA法。很多学者建立了用以诊断DHV的ELISA方法,其优点是灵敏度高,操作简便,特异性强。但因病毒的纯化和DHV阴性血清的制备等均存在一定难度,该方法在DVH的检测诊断方面还未能得到广泛的应用。2.8 其他血清学诊断方法在DVH的诊断上除上述方法外,用来诊断鸭病毒性肝炎的方法还有被动血凝试验，SPA协同凝集试验，胶体金免疫电镜技术，单克隆抗体-PAP法和核酸探针等方法,但因某些原因均还存在一定争议,未能得到广泛推广和应用。3 小结尽管多年来国内外很多学者对DHV进行了大量研究,但到目前为止,尚未能摸索出一种便捷的提纯程序,因而至今尚未得到纯化的病毒,这就使病毒的深入研究大受限制,对其分子生物学特性的研究也难以着手。因此,继续进行病毒提纯方法的改进,将显得尤为重要。对于DHV诊断方法的研究,已经取得了一定的成绩,建立了许多基于血清学的诊断方法,基本能够快速简便地做出实验室诊断,但基层应用存在一定的困难。也有很多学者建立了DHV的cDNA文库,但还都有待于验证,并未见公开的DHV序列报道。因此,应加紧其分子生物学研究,明确病毒的核苷酸序列，基因结构，编码蛋白质的方式。用基因工程技术表达的重组抗原,或根据蛋白质分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列。人工合成的多肽片断抗原运用到免疫学检测方法中,或建立一种快速而准确的分子生物学诊断方法,以解病毒是否存在着变异等难题。