鸡新城疫诊断的技术

    自1926年认识新城疫(ND)以来，许多国家都把ND看作是地方性流行病。除少数几个国家按商业级别生产家禽外，所有国家都作预防免疫接种。  鸡新城疫病毒(NDV)不同毒株的最特征的性质之一，是对鸡的致病性差别很大。根据在感染鸡所引起的临床症状可将NDV毒株分为5个群或病型，它们是：亲内脏的强毒力型，特点是高致病性，常常见到肠出血病变；亲神经的强毒力型，特点是有高的残废率，常有呼吸和神经症状；中等毒力型，特点是有呼吸症状，偶有神经症状，但残废率低；温和型或呼吸型，特点是症状温和或者亚临床型呼吸道感染；无症状的肠型，特点是常为亚临床型肠感染。 病型的划分很难界限分明，甚至在感染的无特定病原(SPF)鸡上也可以看到各型症状的重叠。此外，当与其他微生物混合感染或者当环境恶化时，温和毒株也可引起明显的临床症状。 由于鸡感染后的临床症状差别很大，不同宿主对感染的反应也不一样，这使诊断更为复杂。因此依据单一临床症状不能作为诊断ND的基础。若出现强毒力病型的有关症状和病变应怀疑本病。  ●病原鉴定：  1.样品采集 从死禽采集的样品有口鼻拭子，还有肺、气囊、肠、脾、脑、肝和心组织，这些样品可单独或混合采集。 从活禽采集的样品应包括气管和泄殖腔拭子。在采集样品机会少的地方，除了受感染的或者有相关临床症状的器官和组织外，主要的应是泄殖腔拭子(或粪便)和气管拭子(或者气管组织)。 2.样品处理 样品置于含抗生素的磷酸盐缓冲液(pH7.0至7.4)中，抗生素视具体情况而变化，但对组织和气管拭子应含青霉素(2000单位/ml)，链霉素(2mg/ml)，卡那霉素(50μg/ml)和制霉素(1000单位/ml)，而对粪便和泄殖腔拭子其浓度要提高5倍。加入抗生素后调节pH值到7.0至7.4是很重要的。粪便和搅碎的组织，应用抗生素溶液制成10至20％的悬液。样品应尽可能快地处理，首先在室温下静置1至2小时。没有条件的话，样品可在4℃保存几天。 3.样品检查 粪便或组织的悬浮液经离心后取上清液，尿囊腔接种至少5个9至11天的SPF鸡胚，在35℃～37℃培育4至7天。收集死的和快死的以及培养结束时活下来的鸡胚尿囊液，于4℃致冷，随后检测尿囊液的HA活性。阴性者至少用另一批蛋再传代一次。 用特异性的抗血清可以证实NDV的存在，通常使用鸡的抗血清，它们是用NDV毒株中的一个毒株制备的。 试验以相同的血清PBS作连续对倍稀释，每孔0.025ml，随后每孔加入4个血凝单位的抗原0.025ml，作用15至30分钟后，加入1％的0.025ml鸡红细胞，轻轻混匀，45分钟判定结果。能完全抑制4个抗原的血清最高稀释度即为血凝抑制(HI)滴度。将板倾斜判读，凝集试验更准确。只有那些孔的红细胞同不含病毒对照孔的红细胞出现相同的“流动”时才认为是血凝抑制。 有些非鸡的禽类血清含有对鸡红细胞所特有的非特异性凝集素，因此，可用鸡血红细胞吸收试验血清，以排除凝集素或者采用研究对象的动物种的红细胞。 4.分离株毒力评价 不同NDV分离株的毒力很不相同，而且由于新城疫活苗的广泛应用，仅从具有临床症状的病禽分离出病毒进行鉴定，不能构成对ND的诊断，还应进行分离物毒力的评定。NDV分离株的致病性不能在体外进行，所以评估致病性常根据下面一种或多种试验来确定。 a)鸡胚平均死亡时间(MDT) 将新鲜的感染尿囊液用生理盐水连续10倍递增稀释成6Log10～9Log10，每个稀释度接种5个9至10日龄的SPF鸡胚，每个鸡胚接种0.1ml，随后置于37℃。剩余下的病毒稀释液保存于4℃，于8小时后，每个稀释度接种另外5个鸡胚，每个鸡胚接种0.1ml，置于37℃培养。每天观察二次，共观察7天。每次观察都要记录每个鸡胚死亡的时间。 利用鸡胚平均死亡时间可将NDV株分为强毒力型，其死亡时间低于或等于60小时；中等毒力型，其死亡时间在61至90小时之间；温和型，其死亡时间大于90小时。 b)脑内致病指数(ICPI)  4Log2以上血凝滴度的新鲜感染尿囊液，用等渗无菌盐溶液作10倍稀释，不加添加剂，脑内接种1日龄的SPF雏鸡，共接种10只，每只接种0.05ml。每24小时观察一次小鸡，共观察8天。每一天观察应给鸡打分，正常鸡记作0，病鸡记作1，死亡鸡记作2，脑内致病指数是每只鸡8天内所有每次观察数值的平均数。最强毒力病毒的脑内致病指数将接近最大值2.0，而温和型毒株的值接近0。 c)静脉致病指数(IVPI)  血凝滴度高于4Log2的新鲜的尿囊液用灭菌等渗盐水作1∶10稀释，由静脉接种6周龄的SPF小鸡，接种10只，每只接种0.01ml。每天观察一次，共10天。每次观察要记分，正常鸡记作0，病鸡记作1，瘫痪鸡记作2，死亡鸡记作3，静脉致病指数是指10天内每次观察每只鸡记录的平均数。温和型毒株和一些中等毒力型毒株的值为0，而强毒力型毒株可达到3.0。但这些试验也可有较小的改动。用未稀释的尿囊液擦拭6周龄的鸡的泄殖腔和结膜代替上述试验，其目的在于区别亲内脏的强毒力型和其他强毒力型病毒。 ●血清学试验 ND病毒可作为抗原，用于各种血清学试验，例如中和试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)。目前大都使用血凝抑制试验。鸡血清在这种试验中很少有非特异性反应，所以血清不要作预处理。除鸡以外的其他禽种血清，有时对鸡的红细胞有凝集作用，故试验前应首先测定这种特性，然后用鸡红细胞对试验血清进行吸附，以排除非特异性凝集。 国际ND参考血清可从英国苏里州的中心兽医实验室国际生物标准实验室获得。用它来标定实验室的参考血清。 在诊断中血清学的值同感染家禽的免疫状态有关。如果按1∶8稀释的血清或者高于这个稀释度能抑制4个血凝单位的抗原，被判为阳性。 为评价鸡群的免疫状况可用血凝抑制试验，当我们正在对免疫过的鸡群进行监测，有可能检出突然升高的抗体应答，这是野毒感染所致，但应注意其他原因引起的变化，例如已免疫新城疫病毒的火鸡再感染PMV―3病毒时，滴度会升高。