转基因鸡的制作法及应用

    转基因技术的发展令人瞩目，其中植物、微生物转基因技术成果已经产业化，为人类带来了巨大的经济效益。转基因动物特别是转基因家禽由于具有更为优秀的生产能力和良好的市场前景，从而成为国内外研究的热点。 一、转基因禽类的制作方法 1.通过显微注射生产转基因鸡 （l）单细胞受精卵显微注射法。人们发现，当外源DNA注射到海胆、斑马鱼和爪蟾等脊椎动物受精卵细胞质中，当卵快速分裂时，外源DNA能暂时停留染色体外复制，并可低频率地结合到染色体基因组中。得益于上述研究的启示，在体外将外源基因注射到单细胞受精卵细胞质中，经过体外培养后，成功地产生了转基因鸡。但是，此种方法取到一个受精卵需要一只母鸡，若操作失败，一个细胞的损失就相当于一只母鸡的损失，成本较高，并且受精卵体外孵化条件也很复杂，操作难度较大。 （2）受精卵原核注射法。在国内，李赞东等将脂质体包装后的质粒pMiwz（含有报告基因LacZ）注入囊胚期胚盘中，转基因获得成功，并证明囊胚期注射外源基因可以获得转染的原生殖细胞（PGCs），并能够传给下一代。在国外，Jamie love等将带有目的基因质粒DNA注射入鸡受精卵的胚胎中，体外培养12h后发现近一半存活，40％胚胎中含有质粒DNA，有6％相当于每一个细胞含有1个拷贝的外源基因，7只存活至性成熟雏鸡中的一只将3.4％外源基因传递给其后代。此种方法可以得到转基因嵌合体鸡，但转基因细胞的嵌合部位和嵌合程度不容易确定。 2.鸡卵原始胚细胞的弹道转染 该技术最初应用于植物细胞的转基因操作，其中包括两大组成部分：离子加速系统和离子包装系统。此种方法效率较高，并且由于用的是不同大小的钨离子，而且胚胎新月区下主要是卵黄蛋白，所以不必考虑投射弹的速度和穿入的深度（白占涛等，2000）。但是，由于此方法导入的DNA很难整合到鸡的基因组中，故遗传稳定性和传代性不强。 3.逆转录病毒载体法 此法是利用病毒正常生命周期特征来感染家禽，从而导入外源并达到整合的目的。现在使用的病毒载体有两类：复制完全型和复制缺陷型（高波，2000）。复制完全型逆转录病毒包含全部结构基因能自我复制，并能重复感染细胞。而复制缺陷型逆转录病毒缺乏部分或全部结构基因，不能自我复制，需在辅助细胞中繁殖。反转录载体法的整合效率比电穿孔和脂质体转染法要高，但是由于基因片段大小的限制和获得高滴度病毒有困难，所以目前主要停留在实验室阶段，还未广泛应用于商业生产（刘向萍，2003）。 4.精子载体法 这种方法利用精卵结合的正常生理过程来完成外源基因的导入，具有简便易行，对卵原核无损伤等特点，但对精子的损伤是十分棘手的问题，并且整合度也不高。 （1）脂质体介导精子载体法。在国内，杜立新等曾对此方法作过探讨，其大体实验步骤包括：脂质体-DNA复合的制备，mDm-His法获能精子的人工授精、转基因鸡的检测。发现的问题是精子活力下降、外源基因表达率随胚胎发育而降低等问题。 （2）精子细胞电穿孔法。电穿孔法是促进DNA与动物精子结合的一种重要方法。它利用高压电场使精子质膜产生暂时性孔洞，从而使外源DNA比较容易地进入细胞内。钟家玉研究发现，先让精子脱水再水化或者对浸浴在外源基因中的精子进行电脉冲，得出的阳性率都比仅仅将外源基因和精子混合大得多。先脱水再置于低渗液，精子会吸入低渗液，而正是这一过程使阳性率大大提高，外源基因非常可能随着低渗液进入精子。 5.胚胎干细胞原生殖细胞操作法 胚胎干细胞（ES）是从早期胚胎的内细胞团经体外培养建立起来的多能细胞系。当ES被注入X期囊胚后可参与包括生殖腺在内的各种组织嵌合体的形成，通常利用反转录病毒载体、电击法等将外源基因导入ES细胞中，将有功能的转入基因整合到ES细胞基因组内的非必需基因位点上，经筛选、培养，而后用于转基因鸡生产。 二、转基因鸡的应用领域 转基因鸡的研究在动物育种、生物制药等方面的应用价值具体表现在以下几个方面： 1.加快QTL选择进程 在某些情况下，转基因家禽可以作为验证候选数量性状位点假设的一种方法。比如，我们已经通过某种分子标记从整个鸡的基因组中确定下了某几个位点中的一个或部分为某一性状的QTL，这时我们就可以对这几个位点进行顺序突变，然后根据表型逐个排除，最终确定主效基因。但是，进行突变或有巨大效应的单个基因插入到基因组后，可能会产生一系列不利的表型反应，如同在高选择强度下对单个性状选择时经常表现的那样，这样可能会给研究过程带来不便，比如很高的死亡率、整体功能的失调等，这些都会影响性状的表现（严华祥，1994）。但是，随着基因组功能研究的深入，许多负表现会被克服，转基因方法可能会取代传统的选择方法。 2.提高肉蛋的产量与质量 可以通过转基因操作将作用显著的激素和生长因子的基因导入鸡的基因组或对某些生产性能不利基因进行剔除，从而大大提高其产量。如把反刍动物小肠细胞中的纤维素酶基因导入鸡体，使鸡体可以分解多糖，这样，就产生了食草而产蛋长肉的鸡，并且增加了鸡的饲料来源。 3.进行抗病育种 应用基因剔除技术破坏鸡体内源的病毒受体基因，可以防止病毒侵入。也可以通过标记辅助选择技术找出与鸡的抗病特性相关的位点，然后进行PCR扩增，再通过适当的方法导入鸡的胚胎细胞，并使用酶切技术对其同源序列进行替换，然后进行胚胎培养，最后结合数量遗传学的方法进行抗病品系培育。 4.生产医用、保健蛋白 继乳腺生物反应器之后，转基因鸡生物反应器又成为新的热点。通过转基因技术导入人和动物各种抗体的基因，用来防治人和动物的疾病，又可将SOD基因和人瘦素蛋白基因导入鸡的基因组中，用来生产化妆品和保健品。因为转基因鸡有着其特殊的优越性，故利用转基因鸡生产药物的研究在国际上受到极大关注和重视，必将产生极大的经济与社会效益。