兔出血症病毒的研究进展

    兔出血症（Rabbit hemorrhagic disease，RHD）俗称兔瘟、兔出血热，是由兔出血症病毒（Kabbit Acmorrhagic disease virus，RHDV）引起的一种急性、高度传染性、高致死性的疾病。以呼吸系统出血，实质器官水肿、淤血及出血变化为特征。1984年2月，该病首先在我国爆发，随后朝鲜、韩国、意大利、德国、印度、法国、前苏联、西班牙、日本、美国和非洲等国家和地区相继有该病流行的报道.国内外学者从形态学、生物化学和分子生物学对该病毒进行了系统的研究。但在对BHDV基因组核酸性质的研究上，曾经发生长期的争论。国际病毒分类委员会（ICTV）2000年最新的报告中将RHDV列入新成立的杯状病毒科兔病毒属。兔出血症（RHD）在流行过程中有一个很特殊的现象，即该病主要侵害成年兔，幼兔反而不易感。从早年的流行病学资料看。3月龄以上成年兔发病率和致死率为90%～100%，2～3月龄家兔为80%左右，1～2月龄家兔为50%左右，1月龄以内幼兔很少发病。该病不仅仅对养兔业造成巨大的经济损失，而且严重威胁濒临灭绝的野兔品种。    1 RHDV的形态特征和基因组结构    RHDV病毒粒子呈球型，直径32～36nm，为20面体对称，无囊膜；病毒粒子的衣壳由32个高5～6nm的圆柱状的壳粒构成，核心直径为17～23nm。采用低温电镜技术可观察到180个衣壳蛋白形成位于2次轴上的90个壳粒，构成T=3的20面体结构，直径为43nm。32个表面空洞位于5次轴和3次轴上，深度和宽度分别为6nm和8nm。90个弧状壳粒可以分为A和B两类。在A和B颗粒之间，可以清楚地看到有一密度条带将两者连接起来。    2 RHDV的理化特性    RHDV在氯化铯中的浮密度为1.29～1.34g/平方厘米，沉降系数为85～162s。对乙醚、氯仿和pH3有抵抗力，能耐受50℃1小时的处理。RHDV能凝集人类的各型红细胞。王克领等研究发现，RHDV对O型、B型和AB型红细胞的凝集反应快而强烈，HA效价很高（5×2E13～5×2E15）；而对A型红细胞的凝集反应慢而弱，HA效价很低（5×2E1）。RHDV也能凝集绵羊、鸡、鹅的红细胞，但凝集能力较弱；不凝集其他动物的红细胞。N.Ruvoen Clouet等1995年报道：RHDV本能凝集脐带和胎儿血红细胞，认为RHDV由位于人类红细胞表面的糖脂携带，而脐带和胎儿血红细胞表面无此物质，同时认为具有弱凝集性（羊等）的红细胞表面有类似的糖脂物质。    现有结果表明，世界范围内的所有病毒分离株似乎均为同一血清型，借助于现有的实验手段尚不能将采自不同地区的分离株区分开。Beminger等比较了采自意大利、韩国、墨西哥和西班牙分离株的血清型，发现仅存在微小的差异。    3 RHDV的检测    兔出血症大多数为最急性和亚急性，发病后精神沉郁，呼吸团难，很快死亡。剖检可见死兔营养状况良好，但出现全身血液循环障碍，实质器官充血、出血。根据这些特点可以初诊，确诊需经实验室检查。    在病死兔的肝组织中含病毒量较多，实验室常用肝组织匀浆粗提物作为检测的基本材料。现已建立的实验室检测方法有：（1）血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验。该法利用了RHDV能凝集人类红细胞的特性，是一种常用和比较方便的方法，但有时会产生假阳性或假阴性而且无法检测到枝蛋白水解酶降解后的病毒颗粒。（2）间接血凝试验（IHA）。杨汉春用纯化病毒，以戊二醛醛化绵羊红细胞为载体，建立了间接血凝试验，用以检测抗体效价。其敏感性比HI高32倍。（3）琼脂扩散试验（AGP）。矫正德等用病死兔肝脏乳剂制备的冻融抗原对感染病毒的兔血清进行试验，检测出了沉淀抗体。（4）酶标抗体技术。王启明等采用双抗体夹心法ELISA试验快速诊断本病，潘荣生等应用双抗体夹心法检测出冻兔肉产品中的RHDV，孙智锋等用单克隆抗体夹心酶联免疫吸附试验检测出未经浓缩的肌肉样品中的RHDV。（5）反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）。Gattre等以5’末喘衣壳蛋白基因为对象设计了RT-PCR和套式RT-PCR，结果说明本法比ELISA敏感104倍，可以检出少至12个拷贝的病毒核酸。张英等用PCR技术也从病料中扩增和检测出RHDV。    另外Geimetti D等以地高辛配基标记的RNA为探针通过原位杂交来检测RHDV，发现注射RHDV8小时后便可在兔的肝脏检测到病毒，而在脾脏无BNA的复制，病毒在肝脏复制后运送至脾脏，在脾脏有成熟病毒粒子池，用此方法检测RHDV比免疫组化法敏感性高。余锐萍等用乙型肝炎表面抗原地衣红染色法检测出RHDV，宋英今等用金银染色三抗体夹心法检测出兔出血症病毒。    4 RHDV的疫苗    由于兔出血症病毒在体外组织细胞的培养方法尚未建立，目前广泛使用的疫苗为组织灭活苗。但随着家兔饲养成本的提高以及非免疫兔的减少，可用于制苗的肝组织日趋减少，使组织灭活苗的成本不断增加，加之组织灭活苗可能导致散毒的缺点，近年来人们对RHDV疫苗的研究便主要着眼于基因工程疫苗。    BogaJ等将VP60的编码序列插入酵母表达系统的5’与 3’端的调空区之间，使之表达VP60类似蛋白（VLP），该蛋白能够对兔产生保护作用。FischerL等将RHDV的VP60基因重组入金丝鹊病毒（仅仅在鸟类中复制）的基因组中，使之表达重组蛋白VCP309，该蛋白对实验感染的兔有保护作用。2000年Fernandez等用李树痘病毒为载体成功表达了VP60的结构蛋白，并用表达VP60的李树痘病毒感染植物的抽提物免疫家兔，效果显著。    另外，最近研究的热点之一是构建重组病毒免疫兔，使其同时具有对多种病毒性疾病的免疫力。BarcenaJ等用减毒的粘液瘤病毒（MV）构建了能表达VP60的重组病毒，表达出的VP60上还带有可转移的胃肠炎病毒（TGEV）的抗原决定簇。用该重组病毒通过皮下注射或口服途径感染兔，可使之同时产生针对MV和RHDV的抗体；另外由于该重组病毒含有TGEV的抗原决定簇，表现出一定的水平转移能力。Torres等对该重组病毒作为疫苗使用的安全性，在实验室条件下进行了评估，发现即便用100倍的试验剂量依然是安全的，未引起家兔的免疫耐受，对孕兔也未造成伤害。另外，还在野外一定限制区域内对该疫苗的水平传播能力进行了测试，发现有50%未接种该病毒的兔得到免疫保护。从而为在野兔中大规模预防MV与RHDV提供了有效途径。    RHDV作为一种新出现的传染病且危害巨大，由于还不能在体外长期传代培养，一定程度上阻碍了对此病的进一步研究，一些性质还不清楚。由于RHDV只感染兔和它的高度毒力，可以考虑应用该病毒作为一些基因工程疫苗的载体。一些国家准备将其作为控制野兔数量的生物手段，鉴于历史教训及环境保护的要求，应该慎之又慎。由于动物出血性疾病对研究由病毒引起的人类出血性疾病可以起模型作用，因此近年来对兔出血症的研究趋于升温。