中国林蛙人工催产、授精技术

为了提高中国林蛙南方养殖的繁殖成活率和雌性个体的比例，在不违背中国林蛙繁殖规律的前提下，常用人工催产和人工授精方法按生产计划要求人为控制中国林蛙的产卵时间。人工催产技术和人工授精技术也是治疗中国林蛙难产的有效手段。中国林蛙人工催产、授精过程如图19。1.人工催产人工催产就是通过给卵已经发育成熟的雌性中国林蛙注射脑垂体提取液、绒毛膜促性腺激素或促黄体激素释放激素类似物，使雌性中国林蛙按人为设计的时间产卵。（1）雌性中国林蛙的选择：要选择体内卵子已经成熟的雌蛙，最好选择3年生雌蛙。成熟的卵粒比较大，动物极和植物极开始分化，动物极黑色，约占2/3，植物极为灰白色或白色。未成熟的卵，卵粒较小，两个半球黑白不分明。可将蛙腹侧皮肤剪开一个小口，观察蛙卵是否成熟。（2）脑垂体提取液的制备①脑垂体的摘取与保存：用剪刀剪开蛙的两侧口角，从口角后缘将蛙头剪下，蛙头剪断处露出一个骨孔，称之为枕骨大孔；把蛙头的腹面翻转向上，将剪刀下半部的尖端伸入枕骨大孔，斜向眼球，左右各剪一刀，用镊子翻起剪开的副蝶骨片，即可见到脑腹面的视神经交叉后面有一堆白色的东西，其中有一粒粉红色、约半粒芝麻大的颗粒，这就是脑垂体。寻找脑垂体时要注意，脑垂体有时会黏附在翻起来的骨片上。用镊子小心取下整个脑垂体，取下的脑垂体要马上使用，也可放在冰箱中短期保存（温度保持在4℃左右可保存1个月），若存放于丙酮中，可保存1年以上。②脑垂体的用量：通常催产1只中国林蛙，需用蛙（蟾蜍、青蛙等各种蛙均可）的脑垂体8个。雄蛙的脑垂体效力比雌蛙差。脑垂体的具体用量要根据中国林蛙的个体大小、性别及水温高低等具体情况灵活掌握。如被催产的雌蛙个体较大，催产时水温较低，所用的垂体取自雄蛙，要希望它尽快产卵，则脑垂体的用量应多些；反之，则应少些。据观察，在水温20℃的条件下，50克雌性中国林蛙用8只蛙的脑垂体催产，经6～10小时即可产卵。③提取液的制备：取出所需数量的蛙脑垂体，放入盛有1～1.5毫升0.7%生理盐水的玻璃皿中。取注射器套上大号针头将脑垂体和水吸入注射器中，然后换上中号针头，把注射器内的水和脑垂体挤出，即可使脑垂体破碎；再把脑垂体碎片和水吸入，换上口径更小的针头，然后再挤出，如此反复多次，就制成了脑垂体混悬液，可供注射之用。这种方法制备脑垂体混悬液比较简便，如果用量大，也可用组织匀浆器研磨制备脑垂体提取液。也可以用促黄体生成激素释放激素类似物代替脑垂体提取液，一般用0.7%生理盐水配制，每只雌性中国林蛙的用量为14微克左右，雄性中国林蛙的用量为7微克左右。（3）注射：用注射器吸取脑垂体混悬液或促黄体生成素释放激素类似物药液，先排掉气泡，然后进行皮下注射或腹腔注射。腹腔注射时，不要刺得太深，以免刺伤内脏，最好是针头从大腿腹面的肌肉刺入，再伸向腹腔，这样一般不会刺伤内脏。同时，针尖拔出后，药液也不致从注射孔倒流出体外。注射完毕，把蛙放在一个玻璃缸或其他容器里，加入少量清水，缸口罩以纱布，放置于僻静处。半小时后，若蛙体皮肤颜色变黑，即表明催产有效果。根据催产时的水温和脑垂体的用量，可估计其产卵的大概时间。待卵子全部进入子宫后，轻轻挤压雌蛙腹部两侧，卵会流出，也可以让其自行产出。产出的卵可取之进行人工授精。若将雄性和雌性的中国林蛙放在一起，则会自然抱对受精。2.人工授精首先要准备好精液。取一只性成熟的雄蛙，剖开腹腔，取出睾丸，放于培养皿中，加入5毫升左右干净的池水或井水（忌用新鲜的自来水或沾有油污的水），用镊子将睾丸夹碎，精子就从睾丸游至水中，制成精子混悬液。静置几分钟，等精子充分活跃起来，将蛙卵挤入培养皿，并轻轻摇动培养皿，使卵一一散开，以利于受精。蛙卵刚受精时，有些是动物极向上，有些是植物极向上，有些是侧面向上，没有一定规律。在水温20℃时，授精后10分钟左右，绝大多数卵子的动物极翻转向上，培养皿中水面呈现一片黑色，这种现象称为卵翻转正位，简称卵翻正。卵翻正与否，可作为是否受精的标志。卵翻正后，应倾去精液，换入新鲜清水，以提供充足的氧气，满足受精卵进一步发育的需要。此后，每天都要换水1～2次，直到孵化成小蝌蚪。