鸡马立克病疫苗研究进展

  　鸡马立克病（Marek’sdisease,MD）是鸡的一种淋巴组织增生性疾病。该病的致病因子为马立克病病毒（Marek’sdiseasevirus,MDV），属于疱疹病毒属。世界动物卫生组织（OIE）已将MD归为动物B类传染性疾病。该病是第1个能用疫苗预防的肿瘤性疾病，因此受到了医学界、兽医学界、病毒学界的广泛关注。到目前为止,还没有有效的方法来治疗MD患鸡，仍通过疫苗预防控制该病的发生，所以对MD疫苗的研究一直是国内外众多学者研究的热点。1 常规MD疫苗的类型MDV有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，3种血清型，利用这3种血清型制成疫苗，3种血清型疫苗即可单独使用，也可混合使用。1.1血清Ⅰ型疫苗这类疫苗是用MDV通过细胞培养连续传代而致弱的,疫苗所含病毒是细胞结合性的,只有保证细胞的完整性,疫苗才具有免疫原性。最早的I型疫苗是英国的学者Churchill等研制出的HPRS-16/att疫苗，随后荷兰学者Rispens等将中等毒力的MDV株经鸭胚成纤维细胞（DEF）传代后获得无毒株，并研制成的CVI988疫苗，广泛应用于荷兰和其他国家。因为该毒株有扩散的特性并略微存在致病性，1990年以后英国才准许应用该疫苗。同期由CVI988衍生的疫苗称“克隆C”，据报道可有效抵抗超强毒MDV的感染，该疫苗只在短时间内在美国上市和应用，不久在该国退出应用。“814”株是我国哈尔滨兽医研究所于20世纪80年代研制的另一种疫苗，它可用代次广，抗母源抗体，性能稳定且安全。目前，常将弱化I型强毒株和DNA重组技术结合起来研究新型疫苗。1.2血清Ⅱ型疫苗系一类自然筛选的弱毒疫苗，血清Ⅱ型MDV都是天然非致病性的，广泛分布于鸡群中，这种疫苗毒可通过接触传播，感染后第5周产生很强的免疫力。1988年江苏农学院的黄仕霞等分离出的Ⅱ型Z4弱毒株是国内惟一的Ⅱ型MD疫苗株[5]。这一血清型具有代表性的是SB-1株，制成细胞结合性疫苗，单独使用就能产生广泛的保护力，但对超强毒株抵抗力不太强，可与HVT疫苗合用，充分抵抗超强毒株。美国和其他一些国家有商品SB-1疫苗出售，英国没有，除SB-1外，目前应用的血清Ⅱ型疫苗还有S-24、301B/12。1.3血清Ⅲ型疫此类疫苗是火鸡疱疹病毒(HVT)疫苗,其代表毒株Fc-126是由美国学者WritterRL博士从火鸡群中分离出来的1株无毒力品系，对鸡和火鸡均不致病,在鸡群内不传播；接种这种疫苗的鸡体，细胞中的HVT能使机体产生抗体,但不能中和MDV。该疫苗具有干扰作用，它先于MDV侵入鸡体细胞,能诱发阻止肿瘤形成的抗体，防止肿瘤的形成和发展。这种疫苗广泛应用，可有效抵抗强毒。既有细胞结合性活疫苗，又有易于储存、运输的冻干苗，目前正在使用的疫苗有：HVTFc-126和PB-THV1C4。1.4二价苗和三价（多价）苗自20世纪80年代开始，由于MDV毒力出现了超强毒，世界某些地区单价苗免疫失败屡屡发生，因此有些学者提出多价苗战略，先后研制出二价苗和三价苗。WitterRL报道了3种血清型疫苗单独使用和合用时抵抗强毒和超强毒MDV株感染的试验比较，证实了多价苗的效力。在美国主要使用Ⅱ型和Ⅲ型组成的疫苗，即SB-1或301B/12+HVTFc-126，西欧则使用I型和Ⅲ型组成的疫苗CVI988+HVTFc-126；我国使用的二价苗有814+HVTFc-126、SB-1+HVTFc-126及Z4+HVTFc-126。目前，我国使用的三价苗主要由814+SB-1+HVTFc-126组成。利用几种血清型病毒协同保护作用，使MD造成的损失得以降低，但多价苗只能用液氮保存和运输，成本很高。2 MD基因工程疫苗随着生物学技术的发展及其在疫苗研究领域的广泛应用，科学工作者努力研究比天然弱毒组成的常规疫苗免疫效果好，成本低，使用方便的抗MD基因工程疫苗。2.1禽痘病毒为载体的MDV重组疫苗禽痘病毒（FPV）是目前分子量最大的动物病毒，全长约300kb，是极具开发前景的载体系统。科研工作者研究发现MDV的糖蛋白gB具有良好的免疫原性，Chen及Ross等相继克隆并序列分析了MDVgB基因，发现gB编码的100ku的糖蛋白复合物可以激发抗MDV免疫保护反应，NazarianK等已建立表达gB的重组FPV,GA株gB蛋白具有很好的免疫保护作用，该重组病毒对MDV、vvMDV(超强MDV)、RBIB感染发病具有良好的免疫保护作用。YanagidaN等利用随机克隆的PFV的EcoRⅠ片段作为体内重组的同源DNA序列,分别在痘苗病毒7500bp和103bp人工合成的Ps启动子控制下表达了MDVgB蛋白和pp38蛋白，并通过免疫荧光检测筛选出重组PFV。gB蛋白重组PFV，接种雏鸡可使鸡获得抵抗强毒攻击的免疫力，而接种pp38蛋白重组病毒无保护作用。在MDV疫苗研究中，除gB糖蛋白还加强MDV其他糖蛋白的研究,寻找更多的疫苗候选分子。陈志琳等首次以FPV中国株为载体，构建表达MDVgI基因的重组病毒，为研制gI-FPV疫苗奠定了基础，也为进一步研制抗MD多价组合基因工程疫苗提供了有效组分。痘病毒重组表达一些结构性和非结构性MDV1抗原已建立，但没能产生理想的保护，包括gC、gD、UL47、UL48和pp38。接种MDV1或SB-1，能诱导MHC-I限制性的细胞免疫反应，MDV1的gD或gC没有保护作用。但用FPV重组表达的MDV1gC，MDV1gB和MDV1gD抗原混合接种比起单独gB接种，产生加强保护作用。LeeLF等利用rFPVs表达MDV1的gB1,gE,gI,gH和UL32，当用rFPV/gB1gIgEUL32+HVT免疫鸡时保护率达到94%。2.2HVT为载体的MDV重组疫苗HVT基因组可容纳25kb的外源基因,可以插入一些外源基因。用HVT重组病毒表达MDV抗原的优点是二者有交叉抗原反应，从而可以用大量的HVT蛋白来诱导免疫反应，HVT在雏鸡体内维持时间也长，比起FPV来能够长时间的表达MDV的抗原。RossLJN等[14]使用HVT做载体，在TK基因区插入gB构建基因工程苗,虽然TK基因的破坏使HVT在细胞内繁殖能力降低，但这种低效价重组病毒比其野毒株的免疫效果好。重组HVT疫苗的一个重要特点是可以插入多个外源基因，具有多重保护的潜力，人们对此非常感兴趣制成联苗使用,以预防MD和其他禽病。MorganRW等[15]将鸡新城疫病毒(NDV)的融合蛋白(F)基因和血凝素神经氨酸苷酶(HN)基因分别插入HVT非必需基因Us10，构建了NDVF-HVT和NDVHN-HVT两种重组体，它们能在细胞培养物上和鸡体内稳定而充足的感染，NDVF-HVT重组体接种的鸡可同时抵抗NDV和MDV的双重攻击，由此可见，利用HVT为载体结构建多联苗是实际可行的,关键在于插入合适的外源基因。这个重组方法的成功主要依赖于鉴定出了HVT基因的适宜位点，而后插入不削弱鸡体中病毒复制的外源基因，从而产生了理想的表达。迄今为止发现的最适合的插入点是Us10基因片段,它与不知功效的HSVUs10基因同源。ReddySK等[16]又构建了表达NDV的F和HN抗原,MDV1的gC和gB抗原的HVT重组疫苗,输卵管免疫接种结果保护了SPF鸡全身性ND和RBIB。此外，还建立了表达鸡传染性法氏囊病毒（IBDV）的VP2抗原HVT重组苗，在HVT的gI和UL13位点插入IBDV的VP2抗原产生重组疫苗，接种后防止了鸡法氏囊的萎缩。HVT多联重组苗的构建成功不仅可以抗MD，同时还能对新城疫(ND)、IBD等产生保护，具有广泛的开发前景。