锯缘青蟹黄水病病原研究及综合防控初报

    锯缘青蟹简称青蟹，是我国浙江、福建和广东等东南沿海省份的主要养殖品种，因其肉质鲜美，营养丰富，经济价值高而得到持续快速发展，产值达几十亿元。"黄水病"（亦称白水病、白浆病）是目前青蟹养殖发展中的主要疾病之一，其发病范围广、死亡率高，给养殖青蟹造成重大经济损失，严重制约了青蟹养殖的健康发展。该病主要表现为病蟹蟹体消瘦，肌肉白浊，打开蟹盖可见到不同程度的土黄色或浊白色牛奶状液体等症状。    自该病发生以来，不少研究者对其发病原因进行研究，但结果各不相同，其病原至今仍有较大的争议，纪荣兴等1998报道非液化摩拉氏菌是"黄水病"的病原，毛之娟等2001曾报道辛辛那提弧菌等是"黄水病"的病原，宋振荣等1998认为病毒是肌肉坏死"黄水病"的病原，而韩新全等则认为环境因素是诱发"黄水病"的根本原因。笔者通过大量取样发现，所有"黄水病"病蟹的血淋巴和组织中均可发现大量的寄生原虫，经过病原、组织病理、电镜观察以及分子生物学方法研究，确定血卵涡鞭虫Hematodinium.sp是引起养殖青蟹"黄水病"的重要病原。现将调查的初步情况报告如下，希望能为该病的诊断和防治提供科学依据。    1、流行情况    该病主要发生在南方沿海养殖锯缘青蟹当中，在浙江的象山港、三门湾和乐清湾一带，包括三门、玉环、乐清、宁海、象山等地每年均有不同程度的发生，并往往呈暴发性流行趋势，流行率通常在30%～50%左右，平均死亡率达20%，病情重的围塘，死亡率可达60%～70%以上，个别塘甚至出现绝产，给养殖生产带来极大损失。该病通常病情发展缓慢，从发病到死亡往往持续较长时间，但具有传染性，发病率和死亡率高。初步研究发现，其流行与季节、温度、盐度等环境因子、个体大小及性别等可能存在一定的关系。主要发生在每年的6月份～10月份的夏秋季节，其中以7～9月高水温期为发病流行高峰，尤其是在温盐度环境变化较大的梅雨季节和台风季节，会在短时间内出现死亡高峰。另外，小个体较大个体成活率高，雄性个体较雌性个体死亡严重。盐度较低的地区如杭州湾沿岸的慈溪、余姚等地尚未见发生。    2、发病症状    患"黄水病"病蟹通常摄食下降或停止摄食，行动迟缓，严重者往往爬到塘堤或涂面上死亡。病蟹蟹体消瘦，体色暗淡，关节膜处呈黄色或浊白色，部分附肢关节的外壳呈粉红色，步足关节失去弹性、易脱落。剖开步足或大螯，可见肌肉以感染轻重而出现不同程度的白浊液化;打开蟹盖，可见肝胰腺模糊呈红棕色或乳白色，肠胃空，鳃呈土黄色或黑褐色，个别病蟹的鳃并发黑鳃病;甲壳腔内的血液由正常时的蓝青色具较强凝聚性转变为呈淡黄色或浊白色牛奶状不能凝固的变性液体。    组织病理观察发现所有"黄水病"病蟹的血淋巴急剧下降，代之以大量的寄生原虫。病蟹的肝胰脏、心脏、足部肌肉以及鳃等部位亦均充满上述寄生原虫，而作为对照组健康青蟹的各器官组织中则未发现有寄生虫，表明该寄生虫与青蟹的"黄水病"有密切的关系。病蟹在发病中后期，由于寄生虫的大量寄生，导致血淋巴数量急剧下降，并表现出浊白色和不能凝聚等症状;同时其各重要组织器官均发生严重病变，生理功能丧失，进一步导致病蟹死亡。    3、病原形态与分子生物学特性    用1ml注射器先吸取10%海水甲醛固定液0.1ml，再从青蟹围心腔内抽取等量血淋巴液混匀，将固定的血淋巴滴少许于玻片上，盖上盖玻片，于显微镜下观察可见血淋巴急剧下降，代之以大量的寄生原虫。从不同"黄水病"病蟹的乳白色液体中可以发现不同发育阶段的虫体，多数呈卵圆形，有单核、双核或多核期，大小约5～10多微米不等，也可见带2条鞭毛的孢子阶段。分离到的不同阶段虫体与Stentiford所描述的其他甲壳类中寄生的血卵涡鞭虫的营养体、多核原生质体以及带鞭毛的孢子体形态、结构特征极为相似。    取病蟹血淋巴，采用Hudson等1994的血卵涡鞭虫Hematodiniurn.sp特异引物进行PCR扩增，扩增产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，结果发现"黄水病"病蟹的血淋巴样品均能扩增出680bp左右的条带，而对照的健康蟹血淋巴样品则没出现条带。根据扩增产物的测序结果，可以确定该寄生虫为一种血卵涡鞭虫Hemarodiniurn. sp，初步认定其是引起养殖锯缘青蟹"黄水病"的重要病原。    4、感染途径    根据Shield（1994）等研究，血卵涡鞭虫在甲壳类体内寄生阶段的生活史大致包括3个阶段，即营养体阶段、多核原生质阶段及无性繁殖阶段（孢子生殖），通过孢子生殖会产生孢子母细胞，进一步发育形成两种大小形态相异的带鞭毛具有运动性的腰鞭孢子阶段（大腰鞭孢子和腰鞭孢子）。成熟的腰鞭孢子通过口部的甲壳开裂处释放到水体，并能在海水中存活几天时间。根据1998年Appleton等的离体培养结果，其可能进一步发育成为营养体。    有关血卵涡鞭虫确切的感染和传播途径。Shields等认为在大多数海产甲壳类的寄生腰鞭虫中，腰鞭孢子很可能是感染期，但目前尚不清楚其是否可能产生休眠孢子或存在其他中间宿主。研究表明人工注射感染病蟹的血淋巴（包括营养体和腰鞭孢子）能成功感染健康蟹类。但Cachon（1987）利用自由游动的腰鞭孢子浸浴健康梭子蟹却未能感染成功。类似于许多其他甲壳类原生动物，同类相食可能是某些宿主间传播的有效方式。Sheppard等（2003）通过投喂病蟹的方法，在Calllnectes sapidus上获得投喂感染的成功。另外，深海枝角类等饵料生物也有可能是寄生虫的中间宿主，因为在这些饵料生物中也检测到了类血卵涡鞭虫的存在。Meyers等（1996）发现，血卵涡鞭虫可能通过性传播，其存在于一些雄性个体输精管的精液里，但需要进一步研究证实。    对发病情况的调查结果显示，该病与养殖环境存在较大关系，围塘老化、养殖密度高、水交换条件差的池塘容易发病，尤其是在台风、暴雨等环境突变时导致养殖水体盐度、pH值、水温异常变化，青蟹往往由于强烈的应激反应，免疫抗病力下降，导致"黄水病"及并发病的流行。    5 防治建议    目前尚无有效的治疗药物。必须坚持"以防为主、综合治理"的原则予以预防，建议现阶段应从病原控制、苗种质量、环境优化以及养殖青蟹抗病力提高等方面着手，采取积极有效的措施，控制疾病的发生和蔓延：    1、做好放养前的清塘、消毒工作：池塘老化、环境污染严重，是导致各类病害多发的主要原因，必须做好放养前的清淤消毒工作，以控制和消灭病原，切断传播途径。    2、选择健康苗种：放养健壮和不带病原的苗种是养殖生产成功的基础。必须选择体质健壮、无伤病、规格较大的种苗，并经检疫和消毒后才能放养。    3、加强养殖管理、优化养殖环境：控制放养密度、合理投喂饵料、科学管理水质，通过采取物理、化学、生物和生态方法进行养殖环境的调控优化，以控制疾病的发生。    4、减少应激、提高机体抗病力：应激原过于强烈，或持续的时间较长，往往使机体的免疫机能和抵抗力下降从而易受病原体的感染。应尽量减少应激因子，包括环境突变、污染以及人为的各种操作等原因可能对养殖青蟹造成的应激反应;投喂优质饲料、添加免疫激活剂（如多维、免疫多糖、VitC，VitE等），提高机体的免疫力和抗病力。    5、开展配合饲料研究与推广应用：检测发现，作为青蟹主要饲料来源的小虾蟹亦是黄水病病原的携带者，鲜活饲料极有可能是疾病的一个感染途径，同时鲜活饵料的大量投喂也是影响养殖底质、导致水质环境恶化的主要因素，应积极开展人工配合饲料的研制与推广应用。    6、加强监测，防止病原扩散：黄水病是一种危害较大的流行性疾病，应对该病的发生情况进行监测，一旦发现疾病，应及时采取措施控制病原的传播与扩散，病蟹及尸体应作消毒深埋或销毁处理，以免进一步传染。同时必须注意药物的滥用。    7、加强疾病传播途径及养殖技术研究：一方面进一步摸清疾病的感染途径，从源头上控制病原的发生和蔓延;另一方面，要开展健康养殖技术研究，探索适合青蟹产业化发展的高效健康养殖模式，从根本上杜绝该类疾病的发生。