关于猪卵巢卵母细胞体外成熟体系研究和进展

随着胚胎生物技术的日臻完善并逐步应用于家畜的育种和繁殖领域，人们对动物胚胎工程的认识逐渐加深，一系列更深层次的胚胎生物技术越来越受到人们的重视。20世纪80年代以来，人们在家畜卵母细胞体外培养、体外受精、转基因、核移植、胚胎干细胞等方面进行了大量研究，取得显著的进展，这一切胚胎生物技术都离不开卵母细胞这个基本条件，所以卵母细胞体外成熟培养技术是生物技术的基础。1猪卵巢的采集和保存、卵母细胞的采集和选择1.1采集和保存猪被宰杀30min内将卵巢摘下，用生理盐水冲洗，然后放入盛有灭菌生理盐水的广口保温瓶中带回实验室。卵巢运回实验室后，先测量保温瓶内的温度，然后将卵巢从保温瓶中取出，用消毒的剪刀剪除卵巢上的韧带，输卵管及附带的脂肪组织。用灭菌纱布揩净水珠，放置于同温的保存液中保存。1.2卵母细胞的采集方法抽吸法～～～将清理过的卵巢置于培养皿，用带有16#针头的一次性注射器抽吸卵巢表面2～8mm大小卵泡中的卵母细胞，计数后于成熟液中进行体外成熟。剖切法～～～将卵巢置于培养皿，用手术刀片对卵巢皮质进行纵横方向1～2mm间距的切割，用缓冲液反复冲洗，然后将冲洗液全部放入检卵杯中，用注射器吸去上清液及上面的泡沫移至培养皿，置体视显微镜下检出卵丘、卵母细胞复合体和裸卵，计数后于成熟液中进行体外成熟。1.3卵母细胞的挑选将检取的卵丘、卵母细胞复合体(COCs)用含10%FBS的PBS洗涤3遍，然后依据其形态分成A，B，C，D四类A类：卵丘细胞层完整且致密，一般为4～6层，胞质均匀；B类：卵丘细胞层较少，一般为2～4层；C类：卵丘细胞层不全，为半裸卵；D类：裸卵、变形卵，包括退化的卵母细胞。A类和B类用于成熟培养，一般成熟率较高；C类也可用于体外成熟培养；D类不培养，这4种卵子中前2种约占70%～80%，可用于体外培养，后2种则发育能力减退。2卵母细胞的体外成熟培养卵母细胞的体外成熟受培养条件、激素、成熟时间、成熟温度、卵泡大小、卵丘细胞、基础培养基、血清的影响。对卵母细胞进行体外成熟培养可用于体外受精及动物体细胞克隆。卵母细胞体外成熟培养，就是要模拟体内成熟的环境，使从卵巢采集的未成熟卵母细胞达到最后成熟的目的。进行培养时，先将采集的卵母细胞在实体显微镜下经过挑选和洗涤后，然后放人成熟培养液中培养。通常采用微滴培养法，微滴体积为50～200μL，每滴中放人的卵母细胞数按每5μL一个计算单位。卵母细胞移人小滴后，放入二氧化碳培养箱中培养，培养条件为39℃，90%～100%湿度和5%二氧化碳的空气。培养时间为40～48h，卵丘卵母细胞复合体经成熟培养后，卵丘细胞层扩散靠近卵母细胞周围的卵丘细胞呈放射状排列，出现放射冠，则为卵母细胞成熟。3卵母细胞成熟的机理卵母细胞的成熟过程就是卵母细胞的获能过程，这一获能过程包括恢复减数分裂并进入到第二次减数分裂中期的核成熟和经历一系列复杂生理生化变化的细胞质的成熟。由于卵母细胞成熟是决定受精率和受精后的发育能力高低的首要条件，所以说该过程是体外受精和早期胚胎发育所必需。4结论卵巢中卵母细胞生长、发育是一个极其复杂的过程。颗粒细胞和卵母细胞的生长分化是相互依赖的。在众多培养体系中，卵母细胞总是被阻滞于减数分裂，发育至一定阶段后获得恢复减数分裂能力，并最后发育成熟，卵母细胞减数分裂能力的重新获得和它的生长发育是密不可分的两个过程。虽然目前建立的培养体系用于生产成熟卵母细胞的效率仍很低，但我们可以利用那些能够维持不同发育阶段卵母细胞在体外生长发育的培养体系，来有效地研究各种因子对卵母细胞生长发育的调控机制，阐明参与卵母细胞生长过程以及卵泡细胞间信号通讯的分子机制，建立、完善更有益于卵母细胞体外发育的培养体系，从而最终达到在体外生产大量具有发育能力的卵母细胞的目标。