猪繁殖与呼吸综合征免疫学研究进展

    呼吸综合征病毒是能够引起母猪繁殖障碍和新生仔猪呼吸症状的严重危害养猪业的一种重要病原。其特异的免疫学特征给疫苗的设计与研制带来一定的困难。近年来，对其免疫学研究取得了重要的进展，特别是在病原的基本免疫学特征、体液免疫与细胞免疫特征、免疫抑制与免疫调节等方面做了深入研究与分析。同时，也对参与该病免疫应答的细胞及细胞因子和所引起的免疫病理学方面做了详细的研究。这些都为猪繁殖与呼吸综合征疫苗的研究提供了新的思路和方法。     猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒 (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种以感染猪发热、厌食,妊娠母猪晚期流产、早产、产死胎、弱胎和木乃伊胎,各种年龄猪 (特别是仔猪 )呼吸障碍为特征的高度传染性疾病。PRRSV属于尼多病毒目(Nidovirales)动脉炎病毒科动脉炎病毒属的成员，根据病毒的抗原性，基因组及致病性的差异，PRRSV可分为2个型,即欧洲型（LV株为代表株）和美洲型（ATCC-VR2332株为代表株），两种毒株间氨基酸的同源性为 78%～81%。该病于1987年最早发现于美国。1991年荷兰人Wensvoot等首次从发病仔猪和母猪体内分离到了该病毒,当时称为 Lelystad病毒。随后德国、美国、英国等国家和地区也分离到了该病毒。目前,该病已遍及北美洲及欧洲,在全球范围内传播。郭宝清等(1996)首次从国内疑似PRRS感染猪群中分离出 PRRSV,从而证实了本病在我国的存在。该病传播速度快,尤其在技术进步和经济发达国家,由于猪群密集、流动频繁,更易引起流行。在一个严重流行期过后 ,此病常为地方流行性,长期危害养猪生产,给养猪业造成巨大的经济损失。研究表明，PRRSV感染后，猪体免疫系统参与了病毒导致的疾病发生和感染后的免疫保护作用。PRRSV感染后易引起T细胞亚群和肺泡巨噬细胞在数量与功能上的变化；急性期感染能够促进一些细菌和呼吸道病毒的继发感染；同时，E蛋白能够诱导细胞凋亡，PRRSV感染后N蛋白和M蛋白能够较早诱导机体产生抗体，但无中和作用;E蛋白产生的中和抗体有不定期的保护作用。另外，PRRSV感染后也能引起特异性细胞免疫反应。总结近年来的研究，现将PRRS的免疫学最新研究成果综述如下。     1 抗体依赖性增强作用      PRRSV一个重要免疫学特征是抗体依赖性增强作用(antibody dependent enhancement, ADE)。有资料报道，在肺泡的巨噬细胞培养物中，加入一定滴度的PRRSV抗体，可使PRRSV产量明显增加，甚至会提高10倍～100倍。在某些情况下，免疫产生的抗体不但不能提供保护作用，反而有助于病毒的复制。病毒中加入PRRSV抗体可使病毒在胎儿体内的复制比单独注射病毒显著增强，刚断乳仔猪呼吸道疾病的临床症状比其他较大年龄的猪严重,说明ADE在PRRS发病机制及免疫病理学中起重要作用，但目前对PRRS的发病机理仍不清楚,尽管有许多假设（包括免疫抑制）,但都缺乏足够令人信服的证据。PRRSV在体内外都表现ADE，妊娠后期的胎儿已出现主动免疫应答,但此时形成的抗体对跨胎盘感染的PRRSV的ADE效应,可能是母猪妊娠后期流产的主要原因之一。仔猪对PRRSV易感性高归咎于亚中和水平母源抗体的存在, 这些都提示PRRS致病机制可能涉及ADE。另外，ADE可能是由GP5糖蛋白诱导的。     2 T淋巴细胞与免疫相关细胞     淋巴细胞肩负着细胞免疫功能，其中包括Th细胞的辅助功能，Tc细胞的直接杀伤功能，释放细胞因子诱导激活周围细胞和组织发挥免疫效应的迟发性超敏反应及免疫调节功能。现已发现猪感染PRRSV后,外周血淋巴细胞中T细胞亚群有异常变化,PRRSV自然感染猪CD2+ 和CD8+细胞数增多,CD4+细胞数量及CD4/CD8比例下降,研究还发现,感染和未感染猪的胸腺细胞亚群没有差异,这说明PRRSV不调节胸腺内T细胞的变化。猪感染PRRSV以后，肺泡巨噬细胞是该病毒的首选靶细胞，占被感染细胞的80%～94%，而使肺泡巨噬细胞的比例明显降低。Rossow等发现攻击PRRSV之后,淋巴组织(如脾动脉周围的淋巴鞘，扁桃体，肠系膜淋巴结，胸腺皮质)中的淋巴细胞减少,外周血中白细胞数降低,这些变化都会导致感染猪易继发感染。李华等研究表明，外周血CD3+、CD4+、CD8+和SLADR+表达细胞在感染早期比例下降；感染猪扁桃体的CD3+、CD4+和CD8+细胞亚群比例下降；肠系膜淋巴结的CD3+细胞亚群在感染后下降,但是SLADR+细胞亚群有逐渐升高的趋势。因此，仔猪感染PRRSV后淋巴细胞各亚群的比例下降可能会抑制机体对其它病原体的免疫反应,扁桃体的细胞比例变化有利于其他呼吸道病原体的混合感染或继发感染。     3 细胞因子     病毒感染巨噬细胞和单核细胞以及随后造成的细胞死亡，可导致很多单核细胞因子包括IL-1、IL-6和IL-8的释放。IL-1是免疫应答和炎症反应的基本要素和致热原，IL-6参与B细胞的最终成熟和免疫球蛋白的最终合成，IL-8则是T细胞的趋化因子。所释放的其他单核因子还包括TNF-α，INF-α，INF-β。据报道，PRRSV感染早期IFN-γ表达显著增加，而对IFN-γ表达有增强作用的IL-12 p40的表达却呈下降趋势。IFN-γ是Th1类细胞因子的典型代表，并且是促进细胞免疫应答的效应因子，可抑制在巨噬细胞中的复制，其作用机制是能阻断病毒蛋白的正常合成，还能增强巨噬细胞产生超氧阴离子的能力。IL-4很难检测到，它是Th2类细胞因子的主要代表，主要促进机体的体液免疫，推测PRRSV感染后的IL-4表达受到抑制。IL-10的表达水平有轻微的降低，其主要起平衡两类细胞因子并促进细胞极化的作用，推测PRRSV感染后体液免疫受到一定的抑制。    4 体液免疫     猪接触PRRSV后,产生一系列的抗PRRSV 的特异性抗体,首次感染后有助于避免再次感染,但体液免疫在免疫保护作用中的机制尚不完全清楚。接种PRRSV后7 d开始出现抗囊膜蛋白E的抗体,2周后即可检出抗衣壳蛋白N的抗体和基质蛋白M的抗体,多克隆血清在感染早期可强烈吸附N蛋白和M蛋白，4周~5周后才出现特异性中和抗体，在出现中和抗体后,多克隆抗血清主要识别E蛋白,这提示E蛋白在感染的晚期可能诱导产生中和抗体。这与E蛋白的A、B两个抗原位点有关，位点A为非中和位点具有很强的免疫优势，充当诱骗因子的角色；位点B为中和位点，高度保守不具有免疫优势,这或许是病毒在进化过程中所形成的一种自我保护能力，这也可能是PRRSV持续感染及长期病毒血症的原因之一。抗PRRSV的IgM抗体在病毒接种后的5 d~7 d将会出现，在2周～3周后将检测不到其存在；抗PRRSV的IgG在病毒接种后的7 d~10 d首先被检测到，在2周~4周后达到顶峰，将会持续数月，到300 d左右降低到低水平；抗PRRSV的IgA将在病毒接种14 d后才在血清中被检测到，在25 d到达最大值，35 d后则不能被检测到。猪在感染PRRSV后6周~7周才能观察到病毒血症的出现，最初的反应却不是产生干扰素及相关的细胞因子。     尽管抗PRRSV的抗体水平很高，但中和抗体出现较慢，在临床上，PRRSV总是表现为长期的持续性感染，说明体液免疫的保护作用并不完全。并且由于ADE的存在，抗PRRSV的抗体通过Fc受体结合在巨噬细胞上，形成免疫复合物，提高了Fc受体阳性细胞的病毒感染作用，所以，亚中和水平的体液抗体还对PRRSV感染具有促进作用。Molitor T W报道,非免疫母猪所产仔猪被动获得PRRSV抗体不能对攻毒产生保护，而免疫母猪所产仔猪则可被保护；Yoon K J等证明在被动获得抗体的猪体内，PRRSV感染和复制反而得到增强。说明单独用抗体也许不能保护猪不发病,细胞免疫可能保护猪不受PRRSV感染。    5.细胞免疫     有资料表明，细胞介导的免疫反应（CMI）可能在PRRSV感染中起到很重要的作用。 据报道,PRRSV感染后28 d出现抗原特异性的淋巴细胞增生,在第49天达到高峰,第77天时出现下降,重复感染后细胞增生反应的幅度加大。这种增生性反应可被抗CD4+及MHCⅡ类抗原的抗体所阻断,表明这种增生性反应是CD4+及T淋巴细胞依赖性的。PRRSV感染可产生Th1细胞介导的免疫反应,其感染程度也受CD8+反应的影响。在自然感染PRRSV的猪体内，淋巴细胞亚群发生了变化,外周血中CD4+/CD8+细胞的比例明显降低。由于PRRSV常常与继发感染有密切的关系,因此,PRRSV并非总是诱导产生这样的变化,而由于毒株的来源及毒力的差异, 所以不同报道结果也不尽一致,有的甚至产生相反的结果。Bruin M G M等通过淋巴细胞增生试验和病毒特异性干扰素产生的细胞试验，对PRRSV野毒接种猪、伪狂犬(PRV)疫苗接种猪，以及与PRRSV疫苗接种猪的细胞免疫反应进行比较，结果发现，PRRSV野毒接种猪可产生长期而强烈的细胞免疫反应，与PRV疫苗接种猪的细胞免疫反应相当。而PRRSV减毒活疫苗接种猪的细胞免疫反应与保护性极好的PRV疫苗诱导的细胞免疫反应效果相差甚远。     6 免疫抑制     PRRSV主要侵害猪体的巨噬细胞系统，特别是肺泡巨噬细胞，使感染猪的免疫力降低，引发免疫抑制,造成多系统多器官疾病,如病毒血症、间质性肺炎、血管炎、淋巴结病、心肌炎和脑炎等，肺泡巨噬细胞的比例明显降低，肺泡巨噬细胞中的炎性细胞因子(IL-1和肿瘤坏死因子)的活性增强,细胞的非特异性杀菌活性受到抑制,并伴有循环淋巴结细胞的破坏及黏膜纤毛系统清除系统的破坏，对其他疾病的易感性也增强，也可恶化慢性传染性疾病。感染的肺泡巨噬细胞或外周血单核细胞表面的抗原表达调节能力下降或丧失,使在循环抗体存在的情况下,通过细胞免疫监视系统不易将病毒从感染猪中清除而导致长期的病毒血症和持续感染。Galina等证实，PRRSV可加剧猪链球菌(Streptococcus suis，SS)感染。Reeth V发现PRRSV会加重呼吸道冠状病毒(Porcine respiratory corona virus，PRCV)和猪流感病毒(Swine influenga virus，SIV)引发的病情,但对后者的复制无明显影响。Rovira等通过感染试验发现,PRRSV可促进猪圆环病毒2型(Porcine circo virus type 2，PCV-2)在猪体内的增殖,使猪病理变化明显加重。在PRRSV感染猪中,经常分离出猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)、猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)、化脓性放线菌(CA)、副猪嗜血杆菌(Haemophilu parasuis，HPS)等。但也有许多研究证明，PRRSV引起的免疫抑制是暂时性的，仅在肺中并局限于一定的水平。大量试验表明,事先接种PRRSV对随后的HPS、多杀性巴氏杆菌(Pmc)、APP、Mhp等病原没有激化作用,并不加剧它们的致病变程度。这些证据显示,PRRSV对免疫系统的影响也许不是严重而持久的。由PRRSV引发的猪的呼吸道病常伴发细菌感染是PRRSV感染的一大特征,由PRRSV引起的免疫损伤和在合并症中各种病原微生物的关系在试验中没有得到复制，不同PRRSV毒株在诱发机体产生免疫抑制方面的差别也没有得到比较。所以在没有实验室证据前，应慎重看待PRRSV在诱发猪体产生免疫抑制方面的作用。      7 免疫调节      研究表明，感染猪对布鲁氏菌，大肠埃希菌菌毛抗原及灭活的伪狂犬病病毒体液免疫应答增强。迟发型变态反应（DTH）检测表明，感染猪对二硝基氟苯(DNFB)的细胞免疫应答也增强。因此，认为PRRSV感染可引起全身性免疫抑制并无根据,相反却可使多克隆的T和B细胞激活，促进机体免疫的调节。但关于机体免疫调节的作用仍需开展大量研究工作。     8 免疫病理学     PRRS病猪外周血液中淋巴细胞数量明显减少,大多数淋巴细胞变性、坏死，表现出淋巴细胞肿胀、破碎，很难见到正常淋巴细胞；病猪淋巴细胞平均占白细胞的32.9%，而健康猪为40.3%［22］。     几乎所有的病猪的淋巴结都发生了严重的坏死性变化。病理变化主要表现在肺和淋巴结，因为PRRSV主要是在单核巨噬细胞系统内进行复制的,PRRSV侵害免疫器官是因为淋巴结和脾含有丰富的血管及大量的游离或固定的巨噬细胞［22］。当病毒随血流进入淋巴结和脾脏后，除引起广泛性血管炎和炎性细胞聚集外，病毒还随渗出物进入组织各部位并被巨噬细胞吞噬，同时病毒在其内复制，结果造成坏死性炎症的特征性变化；在淋巴结这种损伤几乎是全身性的,脾的这种变化也是普遍存在的,只是程度不同而已。由于淋巴结、淋巴小结和副皮质区及脾脏的白髓和红髓都受到了广泛性的破坏,致使机体的体液免疫和细胞免疫能力降低。猪肺血管内巨噬细胞在清除血液内的细菌和其他有害粒子方面具有十分重要的作用。猪血管内巨噬细胞对PRRSV极为敏感,表现为直接导致受感染的巨噬细胞对血液中异常颗粒物质的清除能力降低,同时对肺泡洗液检查,证实巨噬细胞数量明显减少,正常猪肺泡洗液巨噬细胞占所见细胞的95%,PRRSV感染猪则为50%；Done用PRRS美洲株VR2332感染猪后,观察到感染猪肺部淋巴细胞暂时减少,对循环血液细胞有破坏作用。结果表明,肺泡巨噬细胞、血管内皮细胞及其它部位的单核巨噬细胞系统的细胞都受到了普遍性的损伤，表现为肿胀、坏死、脱落和发生广泛性的溶细胞作用；各级支气管黏膜上皮细胞肿胀、坏死、脱落，从而使支气管、细支气管的清除机能严重破坏。血液涂片检查发现，病猪外周血中的淋巴细胞减少，且多发生变性或坏死；电镜观察发现，淋巴结和脾淋巴细胞的线粒体、粗面内质网都受到了损伤,使其合成和分泌抗体的能力降低,从而不能有效地抵御各种有害物质的侵袭。      PRRS的以上免疫学特点决定了其在免疫防控过程中的种种难题，另外，机体免疫应答机制研究仍不深入，更使当前对该病的防控研究没有可靠的理论依据。因此，进一步进行PRRS免疫机制的研究，开发出安全有效的新型疫苗，为疫苗免疫预防打下坚实的基础尤为重要。同时，在免疫应答机制研究的基础上，进行疫苗免疫佐剂的研究和开发，也是今后需要做的重要工作之一。