猪细小病毒及其鉴别诊断研究

    猪细小病毒是全世界猪群繁殖障碍最常见的病原之一。本病于1967年在英国报道以来，目前已广泛流行于世界各地。我国于80年代初开始研究此病，中国兽药监察所1.982年在国内率先分离到该病毒。相关统计资料显示猪细小病毒病已在我国普遍存在和流行。    猪细小病毒感染的经济损失也是巨大的。据美国每年由该病引起的繁殖损失达450万美圆，我国赵占民调查北京15个猪细小病毒阳性场，1288头初产母猪，产木乃伊和弱胎率59.16%，产死胎率49.17；广西调查2024头初产母猪，非正常子占产子总数的42.2%。    猪细小病毒感染引起母猪，特别是初产母猪产出死胎、畸形胎、木乃伊胎、流产及病弱仔猪。敏感母猪在妊娠期最初70天内感染此病毒就会发生此病。母猪返情、假孕（不分娩）、窝产仔数减少以及猪群总的繁殖性能下降。    但近些年来的研究发现该病毒是导致圆环病毒感染的一个协同病原，是后者流行的一个原因。而圆环病毒则是引起猪体质下降、消瘦、腹泻、呼吸困难，导致猪断奶后多系统衰弱的主要病原。    1 病原学    猪细小病毒的病原是猪细小病毒，属于细小病毒科，细小病毒属。病毒粒子呈圆形或六边形、无囊膜，直径为20nm，基因组为单股。病毒在猪原代细胞如：猪肾、猪睾丸细胞及传代细胞如等细胞上都能生长繁殖，并出现细胞病变，用免疫荧光技术可查出胞浆中的病毒抗原，病毒在细胞中可产生核内包涵体。病毒能凝集人、候、豚鼠、小鼠及鸡的红细胞。    细小病毒毒力有强弱之分，（1）是强毒株，血清阴性怀孕母猪感染后将导致病毒血症，并通过胎盘垂直感染使胎儿死亡；（2）是一种细胞适应后的弱毒株，怀孕母猪感染后不能经过胎盘感染胎儿，而被用作弱毒预苗株。毒株感染细胞中存在干扰缺损颗粒，可干扰或减患的复制，次种干扰作用为宿主机体建立起抵抗的免疫反应提供足够的时间，从而阻止病毒血症的产生和继发胎盘感染。    本病毒耐热性强，在4℃极其稳定，可长期保存。56℃30min加热处理后其感染性和凝集红细胞的能力不丧失，在70℃2h仍不丧失起感染性和血凝活性，到85℃5min才失活。    该病毒对各种消毒剂有很强的抵抗力。对乙醚、氯仿等脂溶剂不敏感，短时间胰酶处理不仅对病毒悬液没有影响，而且还能提高其感染效价。甲醛蒸汽和紫外线也需要很长时间才能杀死病毒。PPV在圈舍及排泄物中自然条件下可生存至少14周。用0.5%漂白粉或氢氧化钠5min可杀死PPV，而2%戊二醛则需20分钟，3%甲醛需2小时。    2 流行病学    猪是已知的唯一易感动物，不同年龄、性别的家猪和野猪都可感染。据报道，在牛、绵羊、猫、豚鼠、小鼠和大鼠的血清中也存在特异性抗体，来自病猪场的鼠类，其抗体阳性率高于阴性猪场的鼠类。    带毒猪是主要传染源，病毒可通过胎盘传给胎儿，形成垂直传播，同时一侧子宫角内的胎儿感染PPV后，可传播给另一侧子宫角的胎儿。本病除可经胎盘感染和交配、人工受精感染外，母猪、育肥猪和公猪主要是通过被感染的食物、环境经呼吸道和消化道或生殖道感染。带毒猪的分泌物和排泄物可保持感染数月，污染的圈舍是PPV的主要储藏所，所以污染的猪舍在病猪移出后空圈四个半月，经通常方法清扫后，当再放进易感猪时，仍有可能被感染，    子宫内感染的仔猪至少可带毒9周，有些具有免疫耐性的可能终生带毒和排毒。感染本病毒的母猪所产的死胎、活胎、仔猪及子宫分泌物中均含有高滴度的病毒。    被感染公猪的精细胞、精索、附睾和副性腺都可分离出病毒，在其配种是易传给易感母猪。    荧光抗体检查证明病毒主要分布于猪体内一些增生迅速的组织，如淋巴生发中心、结肠固有层、肾间质、鼻甲骨膜等。    3 临床表现    本病常见于初产母猪，一般呈地方流行性或散发。在本病发生后，猪场可能连续几年不断地出现母猪繁殖失败。母猪怀孕早期感染时，其胚胎、胎猪死亡率可高达80%～100%。    猪急性感染PPV1～6天后可产生病毒血症，1～2周可通过粪便排毒，7～9天可在血清中检测扫血凝抗体。    仔猪和母猪的急性感染通常都表现为亚临床病例，但在其体内很多组织器官（尤其是淋巴组织）中均可发现有病毒存在。母猪不同孕期感染，可分别造成死胎、木乃伊胎、流产等不同症状。在怀孕30～50天感染时主要是木乃伊胎。怀孕50～60天感染是多出现死产。怀孕70天感染的母猪则常出现流产症状。母猪在怀孕中后期受感染后也可发生经胎盘的感染，但此时胎儿常能在子宫内存活而无明显的临床症状。在怀孕期70天后，大多数胎儿能对病毒感染产生有意义的免疫应答而存活，但这些仔猪常带有抗体和病毒。当早期胚胎受感染时，病毒在子宫内的传播可能较不常见，因为胚胎死亡后可被母体迅速吸收而有效地清除了子宫内的传染源。    此外，本病还可引起产仔瘦小、弱仔，母猪发情不正常，久配不孕等症状。对公猪的受精率或性欲没有明显影响。    4 病变    眼观病变为母猪子宫内膜有轻微炎症，胎盘有部分钙化，胎儿在子宫有被溶解、吸收的现象。感染胎儿还可见充血、水肿、出血、体腔积液、脱水（木乃伊化）及坏死等病变。    组织学病变为母猪的妊娠黄体萎缩，子宫上皮组织和固有层有局灶性或弥散性单核细胞浸润。感染胎儿死亡后可见多种组织和器官有范围广泛的细胞坏死、炎症和核内包涵体。在大脑灰质、白质和软脑膜偶以增生的外膜细胞、组织细胞和浆细胞形成的血管套为特征的脑膜脑炎变化，一般认为这是本病的特征性病变。    5 诊 断    如果发生流产、死胎、胎儿发育异常等情况而母猪没有明显的临床症状，同时有其他证据可认为是一种传染病时，应考虑到本病的可能性。但最后确诊必须依靠实验室检查。可将一些木乃伊化胎儿或这些胎儿的肺送实验室进行诊断。大于70日龄的木乃伊化胎儿、死产仔猪和初生仔猪则不宜送检，因其中可能含有干扰检验的抗体。    本病应注意与猪伪狂犬病、猪乙型脑炎和布鲁氏病等鉴别诊断。    6 防 制    本病尚无特效的治疗方法。主要采取的措施：控制带毒猪传人猪场。在引进猪是应加强检疫，当抗体滴度在1∶256以下或阴性是方可准许引进。引进猪应隔离饲养2周后，在进行一次抗体测定，证实是阴性者，方可与本场猪混饲。一旦发病，应将发病母猪、仔猪隔离或淘汰。所有猪场环境、用具应严密消毒，并用血清学方法对全群猪进行检查，对阳性相猪应采取隔离或淘汰。以防进一步发展，对猪进行免疫接种，有良好的预防效果。美国一研制成弱毒疫苗和灭活苗，对初产母猪进行免疫接种，能有效预防母猪感染细小病毒。灭活苗免疫期可达4个月以上。我国已研制出灭活疫苗，在母猪配种前1～2个月左右免疫，可预防本病发生。仔猪的母源抗体可持续14～24周，在抗体效价1∶80是可抵抗猪细小病毒感染，因此，在断奶时将仔猪从污染猪群移到没有本病污染的地区饲养，可以培育出血清阴性猪群。    综合以上种种，鉴于细小病毒危害的严重性和临床症状的不明显性，早期诊断是预防的关键，所以找寻一种简便、准确的实验室诊断方法将是我们所要解决的首要问题。    目前，我们已经建立了许多种细小病毒的诊断方法。主要包括（1）病原学方面：进行病毒的细胞培养和鉴定或血凝实验或荧光抗体染色实验。用荧光抗体检查病毒抗原是一种可靠和敏感的诊断方法。但其需要荧光显微镜这一特殊的设备，因此限制了该方法在临床的推广。    （2）血清学方面：血清中和实验、血凝抑制实验、酶联免疫吸附实验、琼脂扩散实验和补体结合实验等，都可用于检测本病毒的体液抗体。其中常规诊断方法是血凝抑制实验。病料可采取母猪血清，也可用70日龄以上感染胎儿的心血或组织浸出液。被检血清先经56℃30灭活，加入50%豚鼠红细胞（最终浓度）和等量的高岭土，摇匀后放室温15min，经2000r/min离心10min取上清，以除掉血清中的非特异性凝集素和抑制因素。抗原用4个血凝单位的标准血凝素，红细胞用0.5%豚鼠红细胞悬液。判定标准暂定1∶256。但其存在一定的不足之处，如实验所需的红细胞要现配现用，最多只能保存1周，被检血清的处理也较为烦琐。    可见，使用方便、经济适用、简单易行、准确可靠，适应规模化养殖的早期诊断和及时预防的需要的鉴别诊断方法为人们众望所归。为此，华中农业大学病毒研究室研制开发出猪细小病毒鉴别诊断试剂盒。    7 诊断试剂盒研制的生物学基础    细小病毒作为最小最简单的一类单链线状 DNA病毒，具独特的基因结构，其中多种自主型细小病毒的基因组结构非常相似。PPV具有细小病毒的一般特性，其基因组为单链线状负性DNA。其两端均为发夹结构，3’端102个碱基的回文序列被 2个大小约10个碱基的短回文序列间隔，从而形成“Y”形结构，而5’端127个碱基的回文序列，被24个碱基的短回文序列间隔，折叠成“U”形结构。PPV基因组含有两个互不重叠的主要开放阅读框架（OpenReading Frame）。位于3’端的主要编码病毒结构蛋白（VP，VP2）；5’端的主要编码病毒的非结构蛋白（NSl，NS2，NS3）。非结构蛋白的功能表现为：    （1）非结构蛋白在细小病毒DNA复制和RNA转录过程中具有重要作用，NSl蛋白具有内切酶作用和共价结合5’端序列的特性，从而能共价结合复制型DNA5’末端并具有特意部位的解链活动。 NSl蛋白有A型保守序列，这类序列是与ATPase和GTPase相关的ATP和GTP结合位点，并具有解旋作用，它拓展了病毒DNA的末端的空间构型，起始病毒DNA的复制，所以NSl蛋白是细小病毒DNA复制所必需的。    （2）NSl蛋白与细小病毒的组装密切相关。PPV新合成的单链DNA基因组的5’端通过共价键与NSl联结，在随后的病毒包装过程中NSl被去掉并连在病毒粒子的外层。    （3）非结构蛋白NSl具有抗原性，并刺激机体产生抗体。NSl虽然是微量的，但在病毒复制中，能持续刺激机体产生抗体。当猪感染PPV后，体内将产生抗NSl的抗体，而使用灭活苗免疫的猪则没有这种抗体一基于此，利用杆状病毒体外重组表达的NSl建立了区分PPV野毒感染和灭活疫苗免疫猪的鉴别诊断方法    8 诊断试剂盒研制的过程    本研究在对PPV中国株的NSl基因进行PCR扩增、克隆和序列测定的基础上，进一步对细小病毒进行了深入研究，利用大肠杆菌表达系统成功表达了PPVNSl蛋白作为抗原，建立间接ELISA诊断方法。    通过大量临床血清的检测证实：    （1）特异性实验：用NSl包被微孔板，分别检测猪口蹄疫、猪伪狂犬等猪的阳性血清，检测结果都呈阴性。表明，此诊断方法对猪细小病毒病的检测具有特异性，是一种准确而使用简便的诊断方法。    （2）稳定性实验证实诊断试剂盒在室温下放置的有效使用期可以达到5个月。    （3）灵敏性实验证实其比常规的诊断方法，如HI和LAT等更为灵敏，尤其可以鉴别诊断自然感染和灭活苗免疫猪群。    （4）此诊断方法对于大量血清检测具有省时、便捷、准确的特点，更适应规模化养殖的早期诊断和及时预防的需要。