针对猪圆环病毒的检测技术研究进展

    猪圆环病毒病是由猪圆环病毒(PCV)感染引起的，以免疫抑制为特征的一类病毒性传染病，临床表现主要是由PCV-2引起的仔猪断奶后多系统衰竭综合征。文章就近几年国内外对该病毒检测技术，包括病毒分离、电镜观察、聚合酶链式反应、间接免疫荧光试验、免疫组织化学技术、酶联免疫吸附试验、原位核酸杂交试验等的研究进展做了阐述。      猪圆环病毒病是近年来倍受关注的一种在世界各地广泛存在的慢性疾病，是一系列疾病的总称。自1974年Tischer I等[1]首次发现猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)以来，随着对PCV研究的深入，根据猪圆环病毒的致病性及其基因组差异又可将其分为无致病性的猪圆环病毒1型(PCV-1)和有致病性的猪圆环病毒2型(PCV-2)。PCV-1对猪无致病性，但能产生血清抗体，在猪群中普遍存在，接种2日龄与9日龄的猪无临床症状。PCV-2对猪有致病性，主要导致一种以断奶仔猪呼吸急促或困难、腹泻、贫血、明显的淋巴组织病变和进行性消瘦为特征的新的疾病，即断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)，造成了很大的经济损失。由于猪群中普遍存在着PCV抗体，单一的抗体阳性不能确诊为阳性，确诊必须依靠实验室方法检测出PCV-2抗原或核酸。由于病毒复制困难，所以检测和防控研究非常困难。同时，该病易与一些病毒性和细菌性疾病混合或继发感染，因此仅凭症状、病变及流行病学调查很难做出准确判断。为此，各国兽医工作者进行了大量的研究，建立了多种高度特异性的病毒学、免疫学和分子生物学诊断方法。文章就目前国内外PCV的检测技术研究进展进行综述。     1　病毒分离     猪圆环病毒的分离培养多数是从病猪中采取肺、肝、脾、淋巴结和扁桃体等组织，制成组织匀浆，用氯仿处理除去有囊膜的病毒，接种PK-15细胞，利用氨基葡萄糖短时间处理感染细胞，以促进病毒的增殖。吕艳丽等[2]从北京、河北分离了3株PCV-2，并对其中的2株进行了测序，序列分析比较发现，它们与欧美分离毒株具有很高的同源性。郎洪武等[3]用Dulac猪肾传代细胞分离到了2株圆环病毒。崔尚金等从我国的22个省市分离到了32株猪圆环病毒，并对其中6株进行了测序，呈送到GenBank。另外，还有很多研究人员从各地分离到多株猪圆环病毒。     2　电镜观察     电镜下可以观察到一种较小病毒，是猪圆环病毒特有的直径约为17 nm的球型结构，以及大量不同形态的胞浆内包涵体。     3　聚合酶链式反应检测     聚合酶链式反应(PCR)做为一种快速、简便、特异的诊断方法，目前为病毒学诊断、分子生物学实验最常用的技术，其优点为敏感、特异、快速、准确。在PCV 的检测方面应用广泛，且发展了很多改良的技术。     3.1　多重PCR 检测     Huang C I等[4]建立了一种简单的多重PCR法，可对PCV 进行检测和定型。该方法设计了两套引物，是根据PCV核酸链上的ORF1和ORF2设计的。Calsamiglia M等[5]建立了一种多重PCR法，可对PCV进行检测和定型。作者根据PCV-1和加拿大PMWS猪中分离的PCV-2的ORF1和ORF2序列设计两套引物，这两套引物都可以对PCV进行检测和定型。郎洪武等[3]根据PCV种的特异性和PCV-2型的特异性，设计两对PCR引物，进行多重PCR检测PCV。一对引物扩增出的片段具有PCV种的特异性，扩增区域是相对保守的ORF1部分核苷酸片段，大小约为900 bp。另一对引物扩增出的片段具有PCV-2型的特异性，扩增区域呈可变性相对较大的ORF2部分的核苷酸片段，大小约为470 bp。Kim J等[6]在2003年建立了石蜡包埋组织中同时检测PCV-1、PCV-2和PPV多重套式PCR法，检测了人工感染病例和自然感染病例，结果与原位杂交方法完全一致。     3.2　定量竞争性PCR检测     定量PCR是根据PCR的产物量来推断其原始模板量。Liu Q等[7]建立了竞争性PCR方法检测血清中的PCV 的DNA。选取PCV-1和PCV-2的ORF2中变异性高的区段设计两对型特异性引物，并引入一个外源片段的重组质粒，以此作为竞争性模板，用上述两对引物扩增出的PCV-1或PCV-2片段能够与野毒株的扩增片段相区别。当倍比稀释的已知浓度的质粒DNA和待测DNA共同的PCR产物的电泳条带亮度相同时，便可以推算出待测DNA的浓度。崔尚金等[8]运用此方法在试验过程中采用内标竞争模板，竞争模板和目标模板共用一个反应体系，不仅降低了非内标性模板不同PCR反应管间的差异，而且在对样本进行质控监测，排除了假阴性结果。     3.3　复合PCR检测     复合PCR是一种特殊的PCR技术，即在同一反应体系中加入多对引物，扩增多个基因片段，此法方便快捷，已广泛用于医学临床诊断。芦银华等[9]应用复合PCR，在同体系中用3条引物扩增PCV两种血清型的DNA片段，从而达到PCR扩增一次就可检测鉴别PCV-1和PCV-2的目的。试验从PK-15细胞中扩增出了PCV-1和PCV-2特异的基因片段，表明复合PCR方法的建立，为PCV的检测、分型及临床PMWS的诊断提供了有效的工具。朱军莉等[10]采用复合PCR，对浙江、上海等地的猪场，具有明显的“高热综合征”临床表现猪的淋巴结进行检测，发现PCV-2的阳性率为39.40%，而PCV-1的阳性率为33.33%。     3.4　PCR-RFLP检测     PCR-RFLP是指在生物进化过程中，DNA碱基序列发生插入、缺失或突变，从而改变了限制性核酸内切酶的识别位点，是以PCR快速有效的扩增微量的DNA，再利用限制酶进行多态性分析的试验方法。Fenaux M等[11]利用PCR-RFLP对PCV-1和PCV-2进行检测和定型。根据PCV-1和PCV-2的243 bp片段，利用仅在PCV-2上有的限制性酶切片段位点NcoⅠ来鉴定PCV-1和PCV-2。PCV-2的PCR产物可被NcoⅠ切成168 bp和75 bp的两个片段，而PCV-1上无NcoⅠ的位点，不能被NcoⅠ切割。这样就可以直接区分PCV-1和PCV-2。经电泳分析，PCV-1的酶切片段仍是243 bp，而PCV-2的酶切片段是168 bp和75 bp。吕艳丽等[12]采用PCR从猪的淋巴结和脾脏中扩增出了预期长度的PCV-2 DNA片段，再用限制性内切酶EcoRⅠ酶切鉴定了PCV-2 PCR产物的特异性。     3.5　其他PCR检测     欧阳岁东等[13]报道，应用RT-PCR在福建检测发现有猪PRRSV和PCV-2共同感染。龚振华等[14]设计了针对猪圆环病毒引物的PCR试验，从细胞毒及组织中直接用水煮法提取核酸，操作简便、快速，从核酸的制备到检测出结果只需2.5 h，大大缩短了检测时间。Kim J等[15]建立了固定、石蜡包埋组织中最佳DNA提取及套式PCR检测PCV-2的方法。     4　间接荧光免疫试验     将组织病料接种PK-15细胞玻片培养，丙酮固定，用兔抗PCV高免血清与细胞培养物中的PCV反应，可对PCV进行检测和定型。周继勇等[16]报道，应用间接免疫荧光技术，测定了浙江地区44个猪场2000年－2002年的2 039个血清样本，对不同年龄和品种猪的血清学数据进行了系统分析。结果显示，浙江地区44个猪场均有猪圆环病毒感染，平均阳性率为58.31%，其中种猪感染的血清阳性率为59.38%，断奶以后猪感染的血清阳性率为56.65%。芦银华等[17]应用间接荧光技术对几个地区的64份临床血样进行检测，结果38份血清呈现PCV抗体阳性(59%)，表明PCV 已在我国普遍流行。     5　免疫组织化学技术检测     免疫组织化学技术(IHC)是在抗原抗体特异反应存在的前提条件下，借助于酶细胞化学的手段，检测某种物质在组织细胞内存在部位的一门新技术，即预先将抗体与酶连接，再使其与组织内特异抗原反应，经细胞化学染色后，于光镜或电子显微镜下观察分析的形态学研究方法。Staebler S等[18]利用单克隆抗体的IHC方法，对收集的469头猪的淋巴组织和回肠的石蜡标本进行研究，这种单克隆抗体是针对PCV-2 ORF2遗传密码的衣壳抗体。从28个农场的39头猪的组织标本中检测出抗体。Krakowka S等[19]通过IHC和组织病理学对感染病毒猪进行检测，确定了感染PCV-2的病毒载体，尤其是淋巴组织和肝脏，与感染PCV-2猪的临床表现严重程度有直接关系。Kim J等[20]用IHC从流产胎儿和死产仔猪的巨噬细胞中检测出PCV-2的抗原。     6　酶联免疫吸附试验     针对猪圆环病毒病血清学诊断方法，酶联免疫吸附试验(ELISA)是最主要的试验方法。McKeown N E等[21]利用ELISA，表明由母源抗体产生的对PCV-2感染的保护是由滴度决定的，高滴度产生普遍保护，而低滴度则不产生。Liu C等[22]将编码PCV-2结构蛋白(Cap)的序列克隆到杆状病毒表达载体上，并将重组表达的Cap蛋白纯化后作为ELISA的包被抗原。通过与免疫过氧化物酶单层试验的比较，发现这种ELISA方法的敏感性和特异性都非常高，同时试验表明与PCV-1、PRRSV和PPV都无任何交叉反应。殷鹰等[23]运用ELISA对来自重庆、内江两地3个猪场的89份血清样进行了PCV-2检测，发现有阳性猪场。崔尚金等采用PCV抗原和正常细胞对照抗原，建立了间接ELISA，并被农业部推荐用于流行病学调查。     7　原位核酸杂交试验     原位杂交组织(或细胞)化学技术(ISH)简称原位杂交技术，属于固相核酸分子杂交技术，它区别于固相核酸分子杂交中的任何一种核酸分子杂交技术。核酸杂交是利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键形成稳定的杂交双链。Kim J等[20]用ISH检测了PCV-2的DNA。Segales J等[24]通过ISH得出器官损害的程度越严重，所测出的病毒基因的数量越多，在血清抽样中测出PCV-2的遗传量越高。国内对ISH的报道较少。     8　结语     PCV-2引起的PMWS迄今还没有有效的治疗方法，也没有疫苗可以使用。目前对该病的防控措施还主要停留在加强饲养管理、降低饲养密度、减少应激、控制进出人员和车辆、加强早期疑似感染猪的诊断、隔离、淘汰等方面。国外对PCV的诊断技术进行了大量的研究，已建立了多种方法成功地检测PCV 的抗原、抗体和核酸。国内对PCV的研究还处于起步阶段。由于我国是一个养猪大国，PMWS已在我国广为流行，而我国对PCV病认识不足，尚未确立标准的诊断方法，当务之急是建立一套完整的检测PCV的方法，及早开展PMWS的调查和防控研究，同时期待PCV疫苗的早日问世。